Fertilização In Vitro heteróloga utilizando ovócitos de bovino e sémen de garanhão - Faria, Nuna Isabel Garcia (2012)
A técnica de Fertilização In Vitro (FIV) pode ser utilizada para determinar o potencial de fertilização de sémen uma vez que permite identificar e avaliar as características seminais e observar a ligação e penetração da zona pélucida por parte dos espermatozóides (Spz). No caso de espécies em vias de extinção ou que não sejam utilizadas para consumo tornando-se difícil o acesso aos gâmetas femininos para se proceder à técnica da FIV, recorre-se à técnica da FIV heteróloga. Esta técnica consiste na utilização de gâmetas femininos de uma espécie diferentes da dos gâmetas masculinos e permite-nos avaliar a motilidade, a reacção acrossómica, a penetração no ovócito, a descondensação do DNA e formação de pró–núcleos. Desta forma, este estudo foi efectuado para determinar a capacidade fecundante de dois garanhões utilizando sémen fresco e congelado, recorrendo à técnica de fertilização in vitro heteróloga, utilizando ovócitos bovinos desprovidos de zona pelúcida. A recolha de sémen foi efectuada com uma vagina artificial, modelo Hannover. Após a recolha foram efectuadas avaliações macroscópicas e microscópicas ao sémen: volume, motilidade total, motilidade progressiva e o teste hiposmótico (HosT) e concentração espermática. Após a congelação/descongelação do sémen foram efectuadas avaliações microscópicas. A avaliação da integridade da membrana acrossómica e da membrana plasmática foi efectuada através da técnica de citometria de fluxo, utilizando fluorocromos SYBR-14 e propidium iodide (PI) e fluorescein isothiocyanate conjugated with Peanut Agglutinin (FITC-PNA) respectivamente. Na técnica de fertilização in vitro heteróloga utilizou-se um total de 373 ovócitos co-incubados com sémen fresco e congelado de dois garanhões. Após 18 horas de co-incubação os ovócitos foram fixados numa solução de etanol: ácido acético (3:1, v/v) e corados com 4’,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI). Os ovócitos que apresentaram cabeças de espermatozóides descondensadas ou formação de pró- núcleos foram considerados fertilizados. No que concerne aos resultados da avaliação macroscópica o ejaculado do garanhão A registou um volume de sémen livre de gel de 52,5 ± 2.5 ml e o garanhão B de 22,5 ± 3,2 ml. Na avaliação microscópica, no que concerne à motilidade total do dos espermatozóides, com sémen fresco, o garanhão A apresentou valores de 52,5 ± 4.8% de espermatozóides e o garanhão B de 40 ± 4,1% e com sémen congelado/descongelado o garanhão A apresentou valores de 51,7 ± 1,7% e o garanhão B de 10,7 ± 0,7% de Spz. Quanto à motilidade progressiva, nas amostras de sémen fresco o garanhão A apresentou valores de 40 ± 7,1% Spz e o garanhão B de 27,5 ±2,5% Spz, nas amostras de sémen congelado o garanhão A registou valores de 43,3 ±1,7% de Spz e o garanhão B de 7 ± 0,6% de Spz. Quanto aos valores do teste HosT, nas amostras de sémen fresco o garanhão A apresentou valores de 61 ± 5,2% Spz e o garanhão B de 47,5 ± 11,3% Spz, nas amostras de sémen congelado o garanhão A apresentou valores médios de 48,7 ± 2,9% Spz e o garanhão B de 18,7 ± 2,7% Spz. Relativamente à concentração espermática dos ejaculados, o garanhão A apresentou valores de 199 x 106 ± 33,6 x 106 Spz/ml e o garanhão B 168 x 106 ± 53 x 106 Spz/ml. No que diz respeito aos resultados da técnica de citometria de fluxo, o garanhão A apresentou valores estatisticamente diferentes (P ≤ 0,05) para o sémen fresco e congelado, quando comparado com o garanhão B. Desta forma, na avaliação da integridade da membrana acrossómica o sémen fresco apresentou valores de 91,04 ± 0,7% e o sémen congelado de 76,4 ± 7,79%. O garanhão B apresentou valores de 27.44 ± 2.59 no sémen fresco e de 25.92 ± 2.97% no sémen congelado. No que diz respeito à integridade da membrana plasmática o garanhão A registou valores, no sémen fresco, de 83.6 ± 1.55% e no sémen congelado de 57.69 ± 9.01%. O garanhão B apresentou valores de sémen fresco e sémen congelado de 16.57 ± 3.17% versus 6.87 ± 1.05%, respectivamente. Os resultados da fertilização in vitro heteróloga demonstraram diferenças significativas (P ≤0,05) entre os dois garanhões no que diz respeito à capacidade fecundante. Assim, o garanhão A registou taxas de fertilização com sémen fresco de 51,9 ± 2,25% e com sémen congelado de 34,41 ± 2,7% tendo o garanhão B, com sémen fresco registado valores de fertilização de 48,1 ± 6,95% e com sémen congelado de 13,7 ± 1,6%. Com a realização deste estudo pode-se inferir que a FIV heteróloga pode ser uma técnica alternativa para identificar as diferenças seminais entre machos, podendo servir como ferramenta para prever o potencial de fertilidade do sémen de garanhões.