Long non-coding RNAs at the service of p53 - Melo, Carlos Manuel Almeida Guedes de (2014)
A instabilidade genómica é uma propriedade fundamental subjacente ao processo de carcinogénese, uma vez que confere às células cancerígenas a capacidade para a sua expansāo clonal. A aquisiçāo de um genótipo mutante permite nāo só a expansāo destas células, assim como, a manipulaçāo do ambiente em que estāo inseridas. O genoma possui, no entanto, sistemas de vigilância que detetam e corrigem defeitos na cadeia de DNA. O gene supressor tumoral TP53, mutado em cerca de metade de tumores humanos, é um fator de transcriçāo considerado o ‘guardiāo do genoma’ (Lane, 1992). A ativaçāo multifactorial do gene TP53, que atua via induçāo da transcriçāo de diferentes genes-alvo, classicamente culmina na paragem do ciclo celular, senescência e/ou apoptose das células cancerígenas. Até recentemente, era considerado que a extensa rede de genes-alvo regulada pelo gene p53 era composta apenas por genes codificadores de proteínas. No entanto, tem sido cada vez mais aceite, que os genes codificadores de proteínas regulados pelo p53 nāo sāo causa suficiente para explicar o seu amplo papel como supressor tumoral (Brady et al., 2011). O desenvolvimento de novas técnicas de sequenciação de última geração veio revelar nāo só que a maior parte do genoma de eucariotas é composto por DNA nāo codificante, mas também que estas regiões sāo transcritas numa nova classe de reguladores genómicos, os long non-coding RNAs (lncRNAs). O termo enhancer RNAs, uma classe de lncRNAs transcritos apartir de enhancers (em inglês) e reguladores da expressão génica, foi correlacionado com a expressāo positiva de genes-codificantes de proteínas localizados nas imediações da regiāo nāo-codificante (Kim et al., 2010). Sendo assim, formulamos a hipótese de que o p53 exerça parte da sua actividade reguladora via interaçāo com domínios produtores de enhancer-RNAs. Recorremos à técnica de genome-wide chromatin-binding profiles para testar a nossa hipótese e descobrimos regiões-genómicas ligadas a p53, mas que se localizam a grandes distâncias em relaçāo a qualquer um dos genes-alvo de p53. A análise destas regiões permitiu identificar a presença de elementos conservados de ativaçāo de p53 em domínios epigeneticamente caraterizados como enhancers. Nestas regiões, que designámos de p53-bound enhancer regions (p53BERs), constatámos que sāo produtoras de eRNAs, em resposta à activaçāo de p53. O nosso estudo demonstrou também que os p53BERs aumentam a transcriçāo regulada pelo p53 através de interacções intra-cromossómicas com múltiplos genes-vizinhos. Adicionalmente, mostrámos nāo só que uma das funções dos eRNAs consiste no aumento da transcriçāo mas também na relevância do papel dos eRNAs na resposta regulada pelo p53 (Melo et al., 2013). No seguimento dos nossos resultados, mapeámos todos os enhancers regulados pelo p53 (p53RERs, em inglês) e descobrimos que, enquanto a maioria dos enhancers induzidos por p53 possuem domínios de ligaçāo ao p53 (p53BERs, em inglês), na sua maioria estes domínios estão ausentes (p53FERs, em inglês) o que sugere um modelo de activaçāo diferente. De facto, observámos que para um subconjunto de p53RERs é necessária a presença de um lncRNA activado pelo stress, que denominamos por LED (lncRNA activator of enhancer domains). Demonstrámos que o LED é um factor-alvo de p53 e é importante para a deposiçāo do marcador epigenético de acetilação da histona 3 na lisina 9 (H3K9ac, em inglês) (um marcador de enhancer) no subconjunto de p53RERs. A presença de LED é indispensável para a correcta paragem do ciclo celular, induzida pelo p53. Finalmente, detetamos a presença de LED em diversas linhas celulares cancerígenas e tumores humanos. O trabalho desenvolvido nesta Tese demonstra que os lncRNAs representam elementos funcionais do genoma não-codificante e que desempenham um papel crucial na biologia do cancro, podendo vir a ser utilizados em futuras abordagens terapêuticas.