Aplicação de membranas para clarificação e/ou purificação de um vetor de DNA minicircular - Carvalho, Daniela Maria Domingos de (2023)
O cancro do colo do útero é um dos cancros mais prevalentes em mulheres em todo o mundo. Este tipo de cancro é causado pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV), nomeadamente pelos seus genótipos de alto risco mais virulentos, o HPV-16 e o HPV-18. Após uma infeção persistente, as oncoproteínas E6 e E7 expressas por esses vírus são responsáveis pela inibição e degradação das proteínas supressoras de tumor p53 e pRB, respetivamente. A terapia génica tem sido explorada nos últimos anos devido ao seu potencial no tratamento de doenças adquiridas e incuráveis. Esta abordagem terapêutica baseia-se na entrega de uma sequência específica de DNA exógeno a uma célula hospedeira, para alterar a função de uma determinada molécula que pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento de uma doença. O DNA minicircular (mcDNA) tornouse um vetor de DNA não viral promissor, porque carece de sequências procarióticas consideradas prejudiciais (como genes de resistência a antibióticos, origem de replicação e motivos CpG, geralmente associados a questões de segurança) e, porque é um vetor de menor dimensão quando comparado com o DNA plasmídico convencional (pDNA), apresentando assim melhor eficiência de transfeção, permanência celular e expressão génica. Adicionalmente, os micro RNAs foram identificados como silenciadores de genes que degradam ou inativam um RNA mensageiro específico. Particularmente, foi comprovado que o micro-RNA-375 (miR-375) silencia a expressão das oncoproteínas E6 e E7 em células infetadas por HPV de alto risco. Assim, o presente trabalho visa a produção e purificação de um vetor de mcDNA que codifica o gene pri-miR-375, que futuramente poderá ser utilizado para terapia génica contra o cancro do colo do útero. No entanto, o processo biotecnológico para obtenção de mcDNA envolve várias etapas (nomeadamente centrifugações; concentração com solventes orgânicos; clarificação com altas concentrações de sal; métodos de purificação que consistem em cromatografia de exclusão molecular ou cromatografia de afinidade que são demorados ou não estão disponíveis comercialmente, respetivamente) que tornam o processo downstream bastante caro do ponto de vista da indústria farmacêutica, mostrando assim a necessidade do desenvolvimento de estratégias alternativas. Neste sentido, a presente dissertação sugere uma nova abordagem de recuperação do mcDNA, baseada no tratamento de lisado bruto com terra diatomácea para filtração direta e remoção de todos os detritos celulares e impurezas precipitadas, combinada com uma segunda etapa usando uma membrana cromatográfica Sartobindâ para purificar o DNA eliminando o RNA. Esta abordagem permite a substituição de várias etapas préestabelecidas para a preparação do lisado, nomeadamente a centrifugação dos restos celulares no final da lise alcalina, a etapa de concentração com isopropanol (e respetiva centrifugação) e a etapa de clarificação com sulfato de amónio (e respetiva centrifugação) poupando deste modo recursos, muito tempo ao processo global e, diminuindo o impacto ambiental. Na etapa de purificação, foi explorada a cromatografia de troca aniónica usando duas membranas, a Sartobind® Q75 e a Sartobind® D75. Após alguns estudos preliminares das condições de equilíbrio e eluição, foi otimizada a eliminação de grande quantidade de RNA diretamente no flowthrough, depois do carregamento da amostra de lisado simplificado, e o restante RNA foi eliminado durante um gradiente crescente de NaCl. A eficiência de ambas as etapas deste processo combinado foi comprovada através da quantificação das amostras recuperadas no final de cada etapa, usando uma coluna analítica CIMac™ pDNA e por fim a densidade de bandas do gel de agarose. No geral, os estudos realizados demonstraram a eficiência da estratégia combinada. Esta nova abordagem de preparação do lisado simplificada torna o processo mais rápido, passando a ser realizado em cerca de 40 min, enquanto que a abordagem convencional demora aproximadamente 180 min. Quanto à purificação do lisado, com a membrana Sartobind® Q75 foi possível obter uma recuperação quase total do DNA (» 100%), com uma pureza superior a 99%. No entanto, ainda é necessário realizar mais alguns estudos para melhorar o isolamento e o rendimento máximo do vetor mcDNA recuperado. Assim, espera-se que esta estratégia combinada possa ser ampliada e aplicada com sucesso na indústria farmacêutica para purificar vetores de DNA de forma rápida e económica.