Efflux pump activity in drug resistance of Staphylococcus aureus - COSTA, Sofia Maria Mourão Marques dos Santos (2013)
Staphylococcus aureus é um importante agente patogénico, para o qual estão descritos vários mecanismos de resistência a compostos antimicrobianos, sendo a resistência mediada por bombas de efluxo (MDR-EP) o menos bem caracterizado. Foi objectivo desta Dissertação avaliar a contribuição global destes sistemas de efluxo, em particular, de NorA, Smr e QacA, para a resistência a fluoroquinolonas e a outros compostos antimicrobianos em S. aureus. Foi estudada uma colecção de isolados clínicos de S. aureus resistentes à ciprofloxacina e estirpes de referência. A actividade de efluxo foi avaliada por metodologias baseadas no transporte de brometo de etídeo (EtBr), substrato de MDR-EPs, e pela determinação da concentração mínima inibitória para substratos de MDR-EPs na presença/ausência de inibidores de efluxo. A informação obtida foi complementada pela análise por RT-qPCR da expressão de genes que codificam para as principais MDR-EPs de S. aureus e seus reguladores e pesquisa de mutações associadas aos principais fenótipos de resistência estudados. A relevância de NorA para a resistência aos compostos antimicrobianos foi analisada através da resposta de S. aureus ao stress imposto pelo EtBr. Demonstrou-se que a presença/ausência deste composto promove o aumento/decréscimo da expressão do gene norA com consequente redução/aumento da susceptibilidade a fluoroquinolonas, biocidas e corantes. Foram também analisados os alelos de norA dos isolados clínicos, tendo sido verificada a predominância do alelo norAI. Estes estudos evidenciaram a complexidade da regulação deste sistema, com a identificação de múltiplos factores que contribuem para a modelação da expressão de norA e actividade de NorA. Em relação às bombas codificadas em plasmídeos, verificou-se que tanto QacA, codificada num plasmídeo associado à multirresistência, como Smr, codificada num plasmídeo sem genes de resistência adicionais, desempenham um papel importante na resistência a biocidas, podendo contribuir para a persistência e disseminação em ambiente hospitalar de estirpes resistentes a biocidas e potencialmente resistentes a antibióticos. A caracterização global dos isolados de S. aureus de origem clínica revelou uma contribuição significativa do efluxo para a resistência aos compostos antimicrobianos, com a identificação de um grupo de isolados com actividade de efluxo aumentada e correlacionável com susceptibilidade reduzida a fluoroquinolones e biocidas. A incubação com inibidores de efluxo, em particular as fenotiazinas, promoveu uma redução dos níveis de resistência, sem contudo resultar na reversão do fenótipo de resistência. Os estudos de expressão génica não revelaram uma correlação directa entre maior actividade de efluxo e expressão génica, sugerindo que os isolados clínicos podem já estar adaptados para uma resposta por efluxo na presença de compostos nocivos. Observou-se ainda uma multiplicidade de respostas mediadas por efluxo aos diferentes substratos e suas concentrações, variáveis no padrão temporal de expressão génica, níveis de expressão e genes envolvidos. Os resultados obtidos evidenciam que o efluxo constitui parte da resposta inicial da célula aos compostos antimicrobianos, a qual, no caso das fluoroquinolonas, é seguida pela aquisição de mutações nos genes alvo. Mostrou-se ainda que a pressão exercida por biocidas induz a resistência cruzada a fluoroquinolonas. Em resumo, os resultados descritos nesta Dissertação demonstram a contribuição do efluxo para a emergência de resistência a fluoroquinolonas e outros compostos antimicrobianos e o seu papel na emergência de estirpes de S. aureus multirresistentes em ambiente hospitalar.