Clonagem e expressão de uma potencial colagenase de Aeromonas hydrophila - Cavaleiro, Eliana Marisa dos Santos (2008)
Aeromonas hydrophila é uma bactéria Gram-negativa que causa septicemia quer em peixes quer em humanos. Os principais patologias associados a infecções por Aeromonas são gastroenterites, infecção de feridas e doença sistémica. A patogenecidade deste organismo é multifactorial, possuindo factores na camada superficial proteica (camada S), diversos produtos extracelulares incluindo proteases, hemolisinas e enterotoxinas incluindo a acetilcolinesterase que contribui, significativamente, para a larga distribuição e versátil adaptabilidade a alterações ambientais. As proteases com actividade gelatinolítica possuem também a capacidade de hidrolisar outras proteínas importantes, como o colagénio, contribuindo desta forma para a invasão dos tecidos. Contudo, o papel destes factores na patógenese ainda se encontra por esclarecer. Após um estudo in silico, foi identificada no genoma completo de A. hydrophila ATCC 7966T, uma região codificante AHA_0517. Esta região possui uma elevada similaridade com sequências codificantes para membros da família das colagenases. Seguidamente, foi detectada actividade colagenolítica associada à células usando o péptido sintético 2-furanacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA). No presente trabalho foi descrita a clonagem e expressão desta potencial colagenase em Escherichia coli. Após a amplificação por PCR, usando primers específicos, o gene AHA_0517 foi clonado num vector de expressão pET- 26b(+). A construção foi transformada num hospedeiro de expressão E. coli BL21(DE3) sob o controlo de um promotor reconhecido pela RNA polimerase do fago T7. Análise de restrição e sequenciação de DNA confirmou a construção. O gene AHA_0517 contém 2748 pares de bases, codifica uma proteína com 915 aminoácidos com um potencial péptido sinal. Os extractos celulares de E. coli recombinante exibiram actividade gelatinolítica e colagenolítica. Neste trabalho, foi estabelecido o protocolo para avaliação citotóxica, que permite avaliar o efeito de bactérias transformadas/proteína recombinante no crescimento e na viabilidade de células Vero. Os resultados obtidos sugerem que a expressão desta potencial colagenase pode ter um importante papel na virulência das Aeromonas. ABSTRACT: Aeromonas hydrophila is a ubiquitous Gram-negative bacterium that can cause septicaemia in both fish and humans. The main clinical symptoms associated with Aeromonas infection are gastroenteritis, wound infections, and systemic illness. The pathogenesis of the organism has been known to involve multiple factors like a surface array protein layer (S layer), several extracellular products including proteases, haemolysin, enterotoxins as well as acetycholinesterase which contribute significantly to their wide distribution and great adaptability to environmental changes. Proteases contributing to gelatinase activity can also hydrolyze other biologically important proteins such as collagen, contributing to cell invasion. Nevertheless the precise role of these factors in pathogenesis is still unclear. Following an in silico approach, it was found the AHA_0517 coding region in the complete genome sequence of A. hydrophila ATCC 7966T was detected and selected for further studies. This coding region shared high similarity values with sequences previously identified as codifying members of the enzyme/collagenase family. From this strain, it was also detected cell associated collagenase activity by using the synthetic peptide 2-furanacryloyl- Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA). In the present work we report the cloning and expression of this putative collagenase in Escherichia coli. After PCR amplification using specific primers, the AHA_0517 region was cloned in the expression vector pET-26b(+). The construction was transformed into the expression host E. coli BL21(DE3) under the control of T7 RNase promoter. Restriction analysis and DNA sequencing confirmed the construction. The AHA_0517 gene contained a 2748 bp ORF encoding a 915 amino acid protein with a putative signal sequence. Cell lysates from Escherichia coli exhibited detectable gelatinase and collagenase activities. In this work, the protocol for cytotoxicity examination was established, allowing the investigation of transformed bacteria/recombinant protein effect on growth and viability of Vero cells. Results obtained suggest that collagenase expression may play an important role in Aeromonas virulence.