Extracção e quantificação de proteínas do glúten associadas à doença celíaca na tribo Triticeae - Seabra, Luís Miguel Ferreira Ramos (2015)
A ingestão de glúten por doentes celíacos pode provocar danos no intestino e um conjunto de variadíssimos sintomas que vão desde a alteração dos hábitos intestinais, malnutrição, diarreia, fadiga e perda de peso ao atraso do crescimento, osteoporose, infertilidade e linfoma. Actualmente esta doença afecta cerca de 1% da população mundial. Recorrendo às técnicas actuais de análise proteómica, foi objectivo deste trabalho avaliar a prevalência do péptido 33-mer em 19 variedades de trigo (Triticum spp.), uma landrace (Triticum aestivum L.), 3 variedades de centeio (Secale cereale L.), 12 populações regionais de centeio e um centeio silvestre (Secale vavilovii), cultivados em Portugal. As proteínas de reserva foram extraídas através de dois métodos distintos, as metodologias propostas por Singh e colaboradores, publicada em 1991, e a de “extracção em duas etapas” adaptada de van den Broeck e colaboradores, publicada em 2009. As proteínas foram separadas por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de detergente dodecil sulfato de sódio (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE), transferidas por Western-blotting, e hibridadas com o anticorpo monoclonal “Anti-Gliadin 33-mer (G12)”. Os resultados da técnica de Western blotting foram estimados pela intensidade da marcação de cada perfil proteico, sendo que a cada variedade foi atribuído um valor entre 0 e 15, que corresponde ao somatório dos valores de intensidade obtidos com cada método de extracção e reflecte a capacidade de hibridação do anticorpo com cada variedade em estudo. Posteriormente, 21 bandas das diversas variedades que apresentavam uma elevada capacidade de hibridação com o anticorpo foram isoladas e identificadas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz – tempo de voo (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight, MALDI-TOF). Através dos resultados obtidos foi possível confirmar que as variedades de trigo apresentam, de uma forma geral, uma maior prevalência de 33-mer que as variedades de centeio, 7,1 face a 5,8, respectivamente. Foi possível identificar as diferenças na prevalência entre as várias variedades e foi demonstrado que existe uma maior prevalência deste péptido na fracção das gliadinas que na fracção das gluteninas. O valor mais elevado foi o da variedade de trigo ‘Ariesol’ (11) e os valores mais reduzidos foram os dos centeios ‘Alvão’ e ‘Picasso’ (3). Ao contrário de outros trabalhos, este estudo não permite afirmar que as variedades antigas são menos tóxicas que as variedades modernas, uma vez que os trigos antigos (8) apresentaram capacidade de hibridação superior à média dos trigos (7,1). Foi ainda possível verificar que os trigos duros (tetraplóides) (8,8) apresentaram uma capacidade de hibridação superior aos trigos moles (hexaplóides) (6,5). Das 21 bandas, foi possível identificar 4 sequências proteicas através da utilização da base de dados NCBI (National Center for Biothecnology Information). À luz dos conhecimentos actuais estas sequências não se encontram descritas como associadas à doença celíaca. A metodologia de “extracção em duas etapas” mostrou ser mais rápida e fácil de executar na realização de SDS-PAGE que a metodologia de Singh, usada rotineiramente no laboratório. Complementarmente, o kit Ridascreen permitiu comprovar os resultados gerais obtidos, no entanto, uma vez que detecta uma sequência de aminoácidos (QQPFP) diferente da do péptido 33-mer, alguns resultados foram discordantes dos obtidos com o anticorpo “Anti-Gliadin 33-mer (G12)”.