A Contribuição de Bombas de Efluxo para a Resistência em Arcobacter butzleri

• Main Author: Silva, Ana Luísa Cota Mateiro da
• Publication Date: 2017
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Download full: http://hdl.handle.net/10400.6/6631
• topic: Antibióticos; Arcobacter Butzleri; Bombas de Efluxo; Desinfetante; Inibidores de Bombas de Efluxo; Resistência; Sais Biliares

O género Arcobacter é constituído por 26 espécies reconhecidas até ao momento, de entre as quais Arcobacter butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii são consideradas agentes patogénicos emergentes associados a enterites e bacteremias em humanos. A. butzleri é a espécie mais frequentemente encontrada em amostras humanas, ambientais e alimentares, pertencendo à lista de microrganismos considerados como perigosos para a saúde humana pela Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos. Em paralelo, as elevadas taxas de resistência em A. butzleri têm vindo a aumentar, o que pode colocar em causa o tratamento de infeções graves ou mesmo levar a disseminação de resistência. Assim, considerando que a investigação em torno dos mecanismos de resistência desta bactéria é escassa, mas relevante, o objetivo deste trabalho passou pela avaliação do papel de bombas de efluxo na resistência a antimicrobianos por A. butzleri e estudo da relevância de um sistema de efluxo putativo da superfamília Resistance-Nodulation-cell-Division (RND). De forma a avaliar o papel do efluxo na resistência em A. butzleri, neste trabalho começou por se determinar o efeito de inibidores de bombas de efluxo (EPI) na resistência a antimicrobianos, através da determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de antibióticos, sais biliares e um desinfetante na ausência e presença de EPIs em cinco estirpes de A. butzleri. Seguidamente, através de análise in silico caracterizou-se a bomba de efluxo putativa do tipo CmeABC pertencente à superfamília RND. Por forma a compreender qual o seu papel na resistência de A. butzleri construiu-se um mutante por inativação do gene tipo cmeB da bomba de efluxo tipo CmeABC. Para a construção do mutante utilizou-se o método de transformação natural por mutagénese insercional, através de aplicação de DNA transformante contendo uma cassete de resistência à canamicina flanqueada por regiões integrantes do gene tipo cmeB da estirpe parental. Após a confirmação da mutação, comparou-se a influência da inativação do gene nas CMI a antimicrobianos das estirpes parentais e respetivas mutantes, bem como as alterações sofridas a nível de acumulação de brometo de etídio (EtBr). Com base nos resultados deste trabalho, pôde verificar-se que algumas das estirpes estudadas apresentaram um perfil de multirresistência, sendo que todas elas apresentavam resistência à cefotaxima. Por outro lado, nenhuma estirpe demonstrou resistência à gentamicina. A utilização de EPIs demonstra ter efeito, baixando os valores da CMI a alguns compostos. O PAßN, que é um inibidor de sistemas de efluxo do tipo RND, mostrou ser o inibidor globalmente mais eficaz. Estes resultados, sugerem que as bombas de efluxo RND terão um papel relevante na resistência de A. butzleri a antimicrobianos como a eritromicina, o Irgasan e em alguns casos a sais biliares. A análise in silico realçou a existência de uma bomba de efluxo putativa do tipo CmeABC em A. butzleri que apresenta uma identidade elevada com outros sistemas RND. Através da comparação entre a CMI das estirpes parentais e respetivas mutantes, verificou-se que efetivamente a bomba de efluxo tipo CmeABC tem um papel na resistência de A. butzleri à ciprofloxacina, ß-lactâmicos e eritromicina. Por sua vez, os ensaios de acumulação de EtBr confirmaram uma correlação entre a inativação do gene cmeB e o aumento da acumulação de EtBr, verificando-se que o gene cmeB, e por consequência a bomba de efluxo do tipo CmeABC, tem um papel no efluxo de compostos. Em suma, este trabalho demonstra o papel global das bombas de efluxo na resistência a antibióticos, sais biliares e desinfetante e a existência de uma bomba de efluxo tipo CmeABC funcional com papel na resistência de A. butzleri a alguns antimicrobianos.