Estudo da influência dos siRNAS na replicação do vírus da hepatite delta e análise da expressão genética em células infectadas - MOTA, Sérgio Miguel Regufe da (2009)
O vírus da hepatite delta (HDV) é o único vírus satélite humano conhecido até à data e membro do género Deltavirus. A replicação do HDV ocorre de forma independente da replicação do vírus da hepatite B (HBV) no entanto para formar partículas infecciosas o HDV necessita das proteínas de superfície do HBV. Após a entrada no núcleo o RNA genómico de cadeia simples do HDV replica por um mecanismo de círculo rolante com a produção da cadeia de RNA complementar, o RNA antigenómico. O HDV apenas codifica uma proteína da qual existem duas formas, o antigénio pequeno e o antigénio grande. Apesar de ambos os antigénios partilharem grande parte da cadeia de aminoácidos eles possuem papéis distintos na replicação do HDV. O antigénio pequeno é essencial para a replicação viral enquanto o antigénio grande é necessário para a formação de partículas infecciosas. Apesar da simplicidade do HDV este provoca um agravamento dos sintomas dos pacientes. Na primeira parte do trabalho pretendeu-se compreender as alterações provocadas pela replicação do HDV no proteoma das células. Verificou-se que a replicação do HDV provoca alterações no padrão de expressão de 43 proteínas celulares. Destas muitas encontram-se também diferencialmente expressas durante a replicação de outros vírus de hepatite como a chaperona molecular K, a proteína regulada pelo oxigénio 105kDa ou a ribonucleoproteína La. Também foram identificadas algumas proteínas relacionadas com a defesa da célula à infecção viral nomeadamente a copina I e a anfoterina. Posteriormente analisou-se as alterações no proteoma das células causadas pela expressão transiente de cada um dos constituintes do HDV. Observou-se alterações no padrão de expressão de 25 proteínas na presença do antigénio pequeno e do antigénio grande. Apesar do número de proteínas com o padrão de expressão alterado ser o mesmo os antigénios delta provocam alterações distintas na célula. O antigénio pequeno altera o padrão de expressão de várias proteínas relacionadas com o metabolismo dos ácidos nucleicos como a proteína 1 do complexo alfa, a proteína ribonuclear heterogénea L ou a proteína zinc finger 326. Enquanto a presença do antigénio grande provocava alterações em proteínas relacionadas com o transporte celular, como a proteína relacionada com o transporte de vesículas e com as vias energéticas. Quando as células expressam o RNA genómico apenas se observam alterações no padrão de expressão de 14 proteínas, a maioria delas envolvida em processos relacionados com o metabolismo celular, transporte enquanto que o RNA antigenómico provoca alterações no padrão de expressão de 23 proteínas relacionadas principalmente com o metabolismo de proteínas e com as vias energéticas. Os resultados obtidos por análise do proteoma foram validados por quantificação da expressão da lamina A/C e da ribonucleoproteína La na presença das RNPs virais por western blot. A validação dos resultados obtidos por 2DE para as proteínas: triosefosfato isomerase, proteína H1 de ligação às histonas, ribonucleoproteína nuclear heterogénea H, ribonucleoproteína nuclear heterogénea D e da proteína de choque térmico 105kDa foi efectuada por quantificação do mRNA utilizando qPCR. As proteínas diferencialmente expressas na presença das RNPs virais foram utilizadas na construção de uma rede de interacções proteína-proteína. Foram identificadas várias proteínas nesta rede, que interagem com as proteínas anteriormente identificadas, que estão envolvidas na replicação de vários vírus, nomeadamente a proteína c-myc, e no desenvolvimento de células cancerosas, nomeadamente a proteína 2 de ligação ao receptor do factor de crescimento. Na segunda parte deste trabalho pretendeu-se analisar a capacidade dos shRNAs em inibir a replicação do HDV. Para isso foram construídos vários vectores que expressam shRNAs dirigidos para os diferentes tipos de RNA do HDV. De seguida quantificou-se o número de células que exprimia os antigénios delta na presença dos shRNAs por imunofluorescência indirecta. Verificou-se que todas as sequências utilizadas eram capazes de diminuir o número de células que exprimia os antigénios delta em cerca de 70%. Posteriormente quantificou-se a expressão dos antigénios delta por western blot. Aqui os resultados foram bastante diferentes pois apenas as sequências que tinham como alvo o mRNA viral conseguiam diminuir os níveis de expressão dos antigénios delta. A diminuição dos níveis de expressão do antigénio pequeno chega a ser de 30% enquanto para o antigénio grande observou-se uma diminuição de 60%. Observou-se mesmo um aumento da expressão dos antigénios quando se utilizava shRNAs dirigidos para o RNA antigenómico. Finalmente, para tentarmos perceber a importância da sobreexpressão de algumas proteínas durante a presença do HDV na célula, analisou-se a capacidade do HDV em replicar em células que exprimiam shRNAs contra proteínas celulares. A expressão da lamina A/C, da ribonucleoproteína La, da chaperona molecular DNA K, da proteína regulada pelo oxigénio 150KDa, da chaperonina GroEL e da lamina B2 foi inibida. De seguida quantificou-se os níveis de mRNA do HDV nestas condições. Verificou-se que a inibição da expressão da lamina B2 provocava uma diminuição drástica nos níveis de mRNA do HDV enquanto a diminuição da expressão da lamina A/C provocava um ligeiro aumento nos níveis do mRNA viral. Analisou-se ainda a expressão dos antigénios delta por western blot. Aqui verificou-se que apenas a inibição da expressão da lamina B2 provocava uma diminuição da quantidade de antigénio pequeno presente na célula. No entanto, os níveis do antigénio grande diminuíam durante a inibição da expressão da ribonucleoproteína La, da chaperona molecular DNA K, da proteína regulada pelo oxigénio 150kDa e da chaperonina GroEL. Este trabalho constitui uma primeira abordagem na compreensão das alterações celulares causadas pela replicação do HDV. Permitindo a identificação de várias proteínas envolvidas em carcinomas ou na replicação de outros tipos de hepatite. Foram também identificadas várias proteínas celulares sobreexpressas durante a replicação do HDV que parecem desempenhar um papel importante no ciclo de replicação do vírus. Este trabalho possibilita o desenvolvimento de novas abordagens de modo a investigar e identificar novos alvos terapêuticos.