Helicobacter pylori prophages : distribution, diversity and contribution to bacterial fitness and pathogenicity

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Main Author: Domingos, Carolina Marques
Publication Date: 2023
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/10451/62022
Summary: Tese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Helicobacter pylori prophages : distribution, diversity and contribution to bacterial fitness and pathogenicityHelicobacter pyloriProfagosEstrutura populacionalVirulênciaBiofilmesTeses de mestrado - 2023Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasHelicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa que coloniza cronicamente o estômago de metade da população mundial. A infeção leva à inflamação crónica, e em muitos casos permanece assintomática, mas, em cerca de 20% dos indivíduos infetados, pode levar ao desenvolvimento de várias doenças do trato digestivo, incluindo gastrite crónica, úlcera gástrica ou duodenal, linfoma do tecido associado à mucosa gástrica e cancro gástrico. A infeção por H. pylori difere a nível geográfico e estrato socioeconómico, e nos países em desenvolvimento apresenta uma taxa de 80% de infeção da população, enquanto em países desenvolvidos o número é muito inferior, com taxa de 40%. A prevalência desta bactéria aumenta quando as condições socioeconómicas são precárias, particularmente, as condições de vida em criança que é considerado um fator determinante importante na aquisição da infeção. Estima-se que a infeção ocorre a partir de uma transmissão vertical (pessoa-a-pessoa) via gastro-oral, oral-oral, fecal-oral ou ambos. Para além disso, outra possível forma de transmissão horizontal é através de alimentos contaminados, apesar de esta bactéria sobreviver por um período curto em comida refrigerada e sistemas de distribuição de água. A infeção por H. pylori pode ser erradicada com uma terapia de antibióticos, mas na última década a emergência de estirpes resistentes aumentou de forma drástica. A plasticidade do genoma bacteriano pode explicar o alto nível de adaptabilidade de H. pylori e o seu sucesso como agente patogénico humano. O processo de colonização é facilitado e induz inflamação através de vários fatores de virulência que estão associados com o risco de doenças gástricas severas, como adesinas, motilidade, urease, ilha de patogenicidade Cag e citotoxina vacuolizante. A grande diversidade genética de H. pylori, que é uma bactéria naturalmente competente, pode ser explicada pelo facto de ter uma alta frequência de mutação através do rearranjo do DNA e transferência horizontal de genes (HGT). Estes mecanismos de transferência horizontal são mediados por elementos móveis de DNA como plasmídeos, transposões e fagos, que são cruciais para a evolução bacteriana e plasticidade genómica. Esta bactéria consegue então adquirir genes de virulência e resistência a antibióticos, alterando a sua patogenicidade. Para além disto, a grande variabilidade genética entre estirpes está associada com a população ou a sua origem geográfica, pois a colonização crónica no estômago permitiu que H. pylori evoluísse estratégias de sobrevivência em paralelo com o seu hospedeiro natural, muito antes dos humanos saírem do continente africano. As migrações humanas ao longo do tempo resultaram numa diversidade biogeográfica desta bactéria formando as seguintes populações: hpAfrica1, hpAfrica2, hpNEAfrica, hpSahul, hpAsia2, hpEurope and hpEastAsia. Os bacteriófagos (fagos) são vírus que infetam exclusivamente bactérias e são considerados como o agente biológico mais abundante da Terra, mas estima-se que apenas 1% foi descrito ou identificado. Os fagos podem ser líticos, lisogénicos ou pseudolisogénicos. Num ciclo de replicação lítico, o fago invade o hospedeiro usa os recursos da célula para produzir o seu genoma e proteínas da cápside e provoca a lise libertando múltiplas cópias do vírus. No ciclo de replicação lisogénico, o bacteriófago integra-se no genoma da bactéria ou torna-se um elemento epissomal. Quando a bactéria se multiplica passa à sua progenia o genoma do fago. No entanto, em resposta a alterações ambientais este fago pode entrar num ciclo lítico e elimina o hospedeiro. No ciclo pseudolisogénico, o fago não entra numa via lítica nem se integra no genoma da bactéria o que acontece em hospedeiros com deficiência de nutrientes o que resulta num fago não integrado, semelhante a um epissoma e sobrevive durante um longo período. Uma vez que o status nutricional é restaurado o fago entra num ciclo lítico ou lisogénico. Os bacteriófagos são veículos importantes no processo de HGT entre várias espécies bacterianas e causam a transferência de diferentes genes envolvidos em comportamentos biológicos bacterianos. Com isto, o fago pode expressar genes que não são necessários para o seu ciclo de vida mas beneficiam o hospedeiro, que dependendo do valor de pressão seletiva podem levar à expansão clonal dos mesmos. H. pylori apresenta sequências de profago no seu genoma, que podem formar um profago completo, ou apenas remanescentes, e que estão presentes em cerca de 20% das estirpes, segundo a literatura. Esta diversidade genética adicional pode fornecer vantagens metabólicas ou mecanismos de tolerância que aumentem o fitness da bactéria e ajudar a colonizar diferentes populações humanas. Estas sequências do fago são diferentes entre si e são caracterizadas pela distribuição filogeográfica formando populações: hpAfrica1, hpEastAsia, hpNEurope and hpSWEurope. Existe uma semelhança filogeográfica entre genes do fago e da bactéria o que sugere uma coevolução entre o vírus e o seu hospedeiro. No entanto, ainda não se sabe se funções específicas dos fagos em H. pylori contribuem para o aumento de patogenicidade ou associação a estados específicos de doenças. O objetivo deste estudo foi avaliar a importância de profagos na evolução de H. pylori, como os profagos evoluem no genoma bacteriano e se a presença destes afeta o fitness e patogenicidade de H. pylori. Com isto avaliou-se a distribuição dos profagos em 256 isolados clínicos de H. pylori de diferentes pacientes portugueses e correlacionou-se com dados clínicos, demográficos, resistência aos antibióticos e genes de virulência. Observou-se que mais de metade da população em estudo era constituída por adultos (59.8%) e a maior parte (60.2%) era constituída por pacientes do sexo feminino. Relativamente à distribuição de resistência a antibióticos das estirpes de H. pylori, 65.6% apresentava pelo menos uma resistência a uma família de antibióticos e 16% da população apresentava resistência a mais do que uma família de antibióticos. As resistências mais comuns de antibióticos foram ao metronidazole (43%), eritromicina (43%) e ciprofloxacina (30%). A frequência de genes de profago em H. pylori foi de 38%, valor superior relativamente ao que já foi descrito, o que sugere que a presença de profagos no genoma de H. pylori é mais abrangente em relação ao que se assumia originalmente. Com uma percentagem de 91% para a presença do gene integrase e 9% para a presença dos genes integrase e holina, sugerindo a presença de remanescentes de fagos na maioria dos casos. Nestas estirpes avaliouse a presença do alelo s1 e s2 para o gene vacA e do gene cagA. Concluiu-se que a maioria das estirpes apresentava o alelo s2 (63%) e era cagA negativa (64%). A alta percentagem da presença de genes de profago pode indicar a importância da diversificação do genoma bacteriano e fitness e ter um papel importante em processos de adaptação contribuindo para a evolução da virulência. A correlação entre outras bactérias hospedeiras e a presença de profagos e virulência já foi descrita, mas neste caso não se encontrou correlação entre a presença de genes de profagos e: i) e a resistência da bactéria a antibióticos; ii) a presença do gene cagA e a forma alélica mais tóxica de vacA; iii), e fatores sociodemográficos como a distribuição etária, o género dos pacientes e o tratamento prévio para H. pylori. No entanto, não se pode excluir a possibilidade de existir uma possível correlação entre a existência de genes de profagos e outros factores de virulência não pesquisados no presente estudo, como já foi descrito em bactérias como por exemplo Escherichia coli e Bacillus subtilis. De seguida, fez-se uma análise do genoma dos profagos e uma reconstrução filogenética a partir do gene fágico da integrase deste grupo de estirpes; a árvore resultante revelou quatro clusters que correspondem às populações de prophage sequence typing (PST) que foram hpAfrica1, hpEastAsia, hpSWEurope e hpNEurope. Esta análise ilustrou e corroborou a conservação dos locais de inserção e a diversidade da estrutura populacional dos profagos de H. pylori e sugere um indicativo forte biogeográfico na diversidade genética do gene integrase. Estes resultados são consistentes com o modelo de coevolução entre vírus e hospedeiro. Para avaliar a performance de formação de biofilmes com a presença de profagos, construiu-se mutantes profago-knockout a partir da substituição do gene da integrase por uma cassete de resistência à canamicina. De cinco estirpes selecionadas, apenas uma estirpe (ALG001) foi transformada com sucesso. No estudo de formação de biofilmes observou-se que a estirpe wild-type ALG001 apresentava uma alta produção de biofilmes e a estirpe mutante ALG001 era produtora, embora fraca, de biofilmes, com uma diferença relevante a nível estatístico o que pode significar que a presença de profago pode influenciar a virulência de H. pylori. Para além disto, determinou-se a composição da matrix de biofilmes da estirpe ALG001 através de um tratamento com proteinase K e DNase I a diferentes concentrações e observou-se uma redução na produção de biofilme, tendo-se identificado que as proteínas são fundamentais na formação de biofilmes tanto na estirpe wild-type como na estirpe mutante. Portanto, para progredir neste tópico, será necessário realizar mais estudos no futuro para validar e clarificar as funções específicas dos profagos em H. pylori e o seu papel na virulência deste importante agente patogénico.Helicobacter pylori is a gram-negative bacterium that chronically colonises the stomach of half the world's population. The infection triggers chronic inflammation that remains asymptomatic in many cases but can develop into chronic gastritis, peptic or duodenal ulcers, gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma and gastric cancer. Pathogenesis is driven by several virulence factors such as adhesins, motility, urease, Cag pathogenicity island and vacuolating cytotoxin (VacA). H. pylori infection can be eradicated by treatment with antibiotics, but the last decade has seen a dramatic increase in the emergence of resistant strains. The plasticity of the bacterial genome may explain the high degree of adaptability and success of the bacterium as a pathogen in humans. Studies suggest that prophages inserted into the genome are essential elements for adaptation to hostile environments, as they can act as gene reservoirs and any metabolic advantages or tolerance mechanisms can increase fitness. This study investigated the importance of prophages in the evolution of H. pylori and whether the presence of prophages affects H. pylori fitness and pathogenicity. The distribution of prophages in the isolates was evaluated and it was found that the prevalence was higher than that described earlier (38% vs 20%). However, no correlation with clinical, demographic data and virulence genes was found in these strains. Prophage sequence genomes and phylogeographic distribution were analysed and showed conservation of insertion sites and diversity of prophage population structure, supporting a model of virus-host coevolution. The ability to form biofilms in vitro and their composition between the wild type and the prophage knockout mutant in ALG001 strain were tested and it was found that production decreased in the mutant, which may indicate a link between the presence of prophages and the virulence of H. pylori. In addition, proteins and eDNA were found to be needed for biofilm formation.Oleastro, MónicaDionísio, FranciscoRepositório da Universidade de LisboaDomingos, Carolina Marques202320232026-06-30T00:00:00Z2023-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/62022TID:203492781enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T15:08:56Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/62022Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:35:20.666195Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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