The aroma of portuguese wine grapes: impact of infection with Botrytis cinerea
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/41419 |
Resumo: | Tese de mestrado, Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 |
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The aroma of portuguese wine grapes: impact of infection with Botrytis cinereaTrincadeiraBotrytis cinereaCompostos voláteisCompostos fenólicosGenes do aromaTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado, Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019As uvas são das frutas mais produzidas e comercializadas em Portugal. À escala mundial é um dos frutos mais importantes a nível económico. As uvas que provêm de castas de videira diferentes apresentam características próprias como por exemplo, a cor e o seu aroma (que é constituído por determinadas concentrações de compostos específicos). A Trincadeira é uma das castas mais produzidas em Portugal originando uvas que, mais tarde, podem produzir excelentes vinhos. No entanto, as videiras são suscetíveis a vários agentes patogénicos, sendo a Trincadeira muito sensível ao fungo Botrytis cinerea. Este fungo reduz drasticamente a colheita destruindo parcial ou completamente os cachos de uvas, alterando a sua qualidade e características biológicas. Ao alterar a qualidade das uvas, o seu aroma também sofre várias modificações. Deste modo, o conjunto de compostos voláteis libertados para a atmosfera correspondentes ao aroma vão ser diferentes do que é considerado adequado, prejudicando a produção do vinho feita a partir destas uvas. Esta tese de mestrado tem como objetivo dar a conhecer as mudanças que ocorrem no aroma das uvas da Trincadeira quando infetada pela Botrytis cinerea, que degrada todos os tecidos das uvas. Neste estudo foram utilizadas uvas no seu último estádio de desenvolvimento EL38, também denominado por estádio de colheita. O estudo visa a caracterização dos compostos voláteis livres e glicosilados responsáveis pelo aroma da uva Trincadeira, com e sem a infeção do fungo B. cinerea, e ainda apurar a quantidade de fenóis e antocianinas. Os genes (enzimas) responsáveis pela síntese dos voláteis livres e glicosilados também foram analisados de modo a verificar quais os que obtiveram uma maior modificação e nível de expressão, devido à infeção. A análise dos voláteis foi feita a partir da técnica Headspace solid-phase microextraction (HP-SPME) onde o sumo da uva foi aquecido em banho maria, os voláteis libertados e absorvidos para serem de seguida identificados por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC- MS). Inicialmente foram determinados os voláteis livres e, só após esta análise se determinou os glicosilados com a adição da enzima β-glycosidase. Com base nos resultados deste estudo identificaram-se vários possíveis marcadores da infeção que surgiram face à presença do fungo Botrytis cinerea e também, por parte do aceleramento da maturação do sumo de uva pela enzima β-glycosidase. Com base nestes voláteis identificados na Trincadeira e na bibliografia, selecionaram-se os vários genes que codificam para enzimas envolvidas na síntese de compostos voláteis específicos. Deste modo, procedeu-se à análise da expressão dos genes responsáveis pela origem do aroma por PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) para verificar se estes apresentavam um maior ou menor nível de expressão, em relação ao efeito produzido pelo fungo na sua síntese. No final, apenas os genes referentes aos voláteis livres, hydroperoxide lyase 2 (HPL2) e lipoxygenase C (LOXC) apresentaram um maior nível de expressão quando as uvas se encontravam infetadas. A expressão dos genes referentes aos voláteis glicosilados, glutathione synthetase 21 (GS21) e O-methyltransferase 1 (OMT1) também aumentaram ligeiramente nas uvas infetadas. Esta informação sugere que a infeção com o fungo B. cinerea modifica a expressão destes genes. O HPL2 é expresso quando a uva sofre danos no tecido vegetal ou fica sujeito a stress tanto abiótico como biótico, uma vez que este gene regula o reconhecimento e a resistência tanto a insetos como a agentes patogénicos para mais tarde os eliminar. Com a infeção da Botrytis o HPL2 aumenta a sua expressão na uva infectada. Em relação à enzima LOXC, sabe-se que é responsável pela produção de aldeídos e álcoois e o seu nível de expressão, por norma, decresce no último estádio de maturação da uva (harvest stage). No entanto, durante a infeção a sua expressão aumenta. A enzima GS21 é responsável pelo metabolismo dos aminoácidos e tem como função, prevenir a perda do aroma e o aparecimento de manchas castanhas na pele da uva. Face aos resultados, o nível de expressão nas uvas infetadas e nos controlos é muito semelhante, não se conseguindo obter resultados conclusivos. Eventualmente as alterações a nível de expressão fizeram-se sentir previamente, sendo agora mais presente uma actividade enzimática diferente entre uvas infectadas e controlo. A enzima OMT1 assegura o crescimento e desenvolvimento das uvas assim como do seu aroma. Os resultados desta tese demonstraram existir o aumento do seu nível de expressão após a infeção nas uvas Trincadeira, mas não foi significativo. No futuro, é fundamental voltar a repetir a análise aos voláteis e a estes genes, a partir de mais amostras (réplicas biológicas) e validar esta informação com outras estações produtivas para identificar marcadores metabólicos robustos. Outros genes/enzimas relacionados com o aroma e não estudados neste trabalho, também poderão ser analisados e assim complementar este perfil, inclusive através da análise de bagos menos maduros. Os fenóis e antocianinas foram quantificados para confirmar mais uma vez, as mudanças que surgem nas uvas devido à infeção pela B. cinerea. Para a determinação dos fenóis e antocianinas recorreu-se à liofilização das uvas e à sua quantificação por absorvância no espectrofotômetro após a sua extração por diferentes métodos. Estes compostos são fundamentais para a produção do aroma e para a proteção da uva, através de uma barreira na sua pele criando inibidores de fungos que asseguram a qualidade das uvas e do vinho. Por norma, estes compostos defendem a uva contra o agente patogénico, mas, com uma grande infeção da B. cinerea nas uvas estas perdem a sua capacidade de defesa e ficando muito suscetíveis. Assim, verifica-se uma diminuição gradual destes compostos, no último estágio de desenvolvimento das uvas. Os resultados apresentados neste estudo demonstram essa mesma diminuição, facto confirmado em outras investigações. Um estudo exploratório, para além do proposto inicialmente na tese, foi executado de modo a analisar os fenóis e antocianinas presentes nas uvas com e sem a hormona melatonina. Recentemente descobriu-se o papel desta hormona na proteção das plantas, contra danos, stress abiótico e biótico ou agentes patogénicos como o fungo B. cinerea. Ao tratar as uvas com melatonina promovemos a sua maturação e qualidade. Este estudo teve como objetivo determinar se a hormona adicionada exogenamente iria proporcionar alguma das características atrás referidas. Infelizmente, nos testes realizados nas uvas da Trincadeira e Touriga Nacional não se verificaram mudanças significativas ao nível da qauntificação dos fenóis e antocianinas que permitissem obter resultados pertinentes, sabendo-se ainda muito pouco acerca do papel da melatonina no último estágio de desenvolvimento das uvas. Como conclusão, este trabalho permitiu identificar os compostos voláteis pertencentes ao aroma do sumo de uva da casta Trincadeira do ano 2018, com e sem infeção do fungo B. cinerea. A partir desta informação é possível identificar as mudanças que ocorrem no aroma da uva e determinar o perfil de compostos voláteis característicos da Botrytis cinerea na Trincadeira. A expressão de alguns genes envolvidos no aroma sofreram alterações putativas envolvidas no aroma final das uvas da Trincadeira com e sem a presença do fungo. Estes dados englobam um conjunto de informação necessária para determinar e completar os dados anteriores referentes ao perfil dos compostos voláteis sobre o aroma das uvas com e sem a infeção da Botrytis cinerea. A determinação dos fenóis e antocianinas permitiu verificar mais uma vez a infeção e a gravidade que o fungo Botrytis cinerea produz nas vinhas. Os resultados deste estudo poderão vir a ter impacto na decisão sobre a melhor forma de controlar ou minimizar a proliferação nas uvas, por parte deste agente patogénico. Poderá ainda vir a ser do interesse de alguns produtores vinícolas no que respeita às mudanças que ocorrem no aroma e qualidade das uvas após a infeção.Grapes are one of the fruits more produced in Portugal. Worldwide they are very important economically. Grapes from different grapevine varieties have their own characteristics, such as the colour and the aroma (mixture of certain concentrations of specific compounds). Trincadeira is one of the most important Portuguese grapes but is extremely susceptible to a fungal disease caused by B. cinerea. This fungus destroys partially or completely the grapes bunches, changing their quality and biological characteristics. By changing the quality of the grapes, their aroma also undergoes several modifications. This study aims to characterize how Trincadeira grape aroma changes when infected with B.cinerea, through the analysis of free and glycosidic volatile compounds, the amount of phenols and anthocyanins and the expression of the genes (enzymes) responsible for volatiles production, during the last stage of development EL38 (harvest stage). The volatiles were analysed using the Headspace solid-phase microextraction (HP-SPME) technique where the grape juice was heated in a water bath, the volatiles released and absorbed to be identified by gas chromatography and mass spectrometry (GC - MS). Initially, the free volatiles were determined and only after the addition of β-glycosidase enzyme the glycosylated volatiles were analysed. Based on the results of this study, several possible markers of infection were identified due to the presence of Botrytis cinerea. The analysis of volatiles showed the impact of Botrytis infection since some volatiles increased in response to the infection. During this analysis were found four groups of volatiles in grapes, the C6 alcohols and aldehydes, alkanes, fatty acids and the amino acids derived esters and alcohols. The quantity of C6 volatiles found in infected and non-infected grapes were similar. The alkanes found in the free form were lower in presence of Botrytis. The fatty acids volatiles appeared in the glycosidic form and increased during the infection. The amino acids derived esters and alcohols volatiles (free form) increased due to the infection. The glycosidic form of amino acids decreased during the infection. Based on the volatiles identified in Trincadeira analysis and in the literature, were selected the various genes coding for enzymes involved in the synthesis of specific volatile compounds. The expression of the genes responsible for the aroma were analyse by real-time quantitative PCR (RT-PCR) to verify if they had a higher or lower level of expression, in response to the infection. The expression levels from RT-qPCR analysis of HPL2, LOXC and OMT1 presented an increased during the infection. The HPL2 is released when the grape is damaged or subjected to both abiotic and biotic stresses, it is also involved in resistance to pathogens. The HPL2 had the highest expression levels and better statistical significance between non-infected and infected samples. LOXC is responsible for the production of aldehydes and alcohols and its expression level usually decreases in the harvest stage. However, during the infection its expression increases through not statistically significant. HPL2 and LOXC are the genes responsible for the biosynthesis of C6 aldehydes and alcohols volatiles, which also increased during the infection. The GS21 enzyme is involved in amino acid metabolism and its function is to prevent the loss of aroma and the appearance of brown spots on the skin of grapes. In this study there isn’t a conclusive result, since in both infected and non-infected grapes the expression levels were similar. The enzyme OMT1 is involved in the growth, development and the aroma of grapes. The results show an increase of expression level during the infection in Trincadeira grapes, but it was not significant. These results indicate that changes in the transcriptional profiling of the genes involved in aroma probably occurred at an earlier stage of ripening. Phenols and anthocyanins were quantified to confirm again the metabolomic changes in grapes due to B. cinerea infection. Phenols and anthocyanins were determined using lyophilized samples and quantified by absorbance on the spectrophotometer after extraction by different methods. These compounds are essential in grape quality and for the protection of grapes through a barrier on grape skin creating fungal inhibitors that ensure the quality of grapes and wine. With B. cinerea infection grapes become very susceptible. The phenolic and anthocyanins content decreased during the infection by Botrytis cinerea. An exploratory study, besides the one initially proposed in the thesis, was performed to analyse the phenols and anthocyanins present in grapes with and without melatonin hormone. The role of this hormone in plants is to protect them against damage, abiotic and biotic stresses such as the one cause by fungus B. cinerea. When grapes are treated with melatonin their ripeness and quality are promoted. This study aimed to determine if adding exogenously melatonin would provide any of the characteristics above. Unfortunately, in the tests carried out in Trincadeira and Touriga Nacional grapes, it were not found any significant changes in the phenolic and anthocyanin levels. In conclusion, it was possible to identify the changes that occur in grape aroma and to determine the profile of volatile compounds characteristic of Botrytis cinerea in Trincadeira. The expression of some genes involved in the aroma underwent putative changes involved in the final aroma of Trincadeira grapes with and without the presence of the fungus. The determination of phenols and anthocyanins allowed to verify once more the infection and severity of Botrytis cinerea in the vineyards. The results presented here, are a starting point for the understanding the aroma and quality changes of grapes when infected and could be vital for future vinicultural managements.Fortes, Ana Margarida da Costa Macedo,1973-Figueiredo, Ana Cristina da Silva,1959-Repositório da Universidade de LisboaAugusto, Catarina da Silva2020-01-27T19:09:49Z201920192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/41419TID:202382354enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T14:15:22Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/41419Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:06:52.620661Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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