Crosstalk between the miRNA and the SnRK1 signalling pathways
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| Publication Date: | 2018 |
| Format: | Master thesis |
| Language: | eng |
| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
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Summary: | Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018 |
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Crosstalk between the miRNA and the SnRK1 signalling pathwaysSnRK1miRNAsAGO1Arabidopsis thalianaStress ambientalTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018As plantas, devido à sua incapacidade de locomoção, estão confinadas ao local onde germinaram sendo, por isso, vulneráveis a condições ambientais que restringem o seu crescimento e desenvolvimento. Temperaturas extremas, seca, inundações, elevada salinidade, exposição a metais pesados, lesões mecânicas, condições de luz inadequadas e infeção por patogéneos estão entre as maiores causas de perda de produtividade agrícola a nível mundial. Para fazer face a estas flutuações ambientais, as plantas desenvolveram, por um lado, estratégias adaptativas de sobrevivência de carácter específico, que lhes permitem responder a um tipo particular de stress e, por outro, mecanismos gerais responsáveis pelo ajuste metabólico e pela reprogramação da expressão de genes, permitindo, assim, rapidamente reparar os componentes celulares danificados e alocar nutrientes para os processos adequados, de forma a restaurar a homeostasia. Em condições normais, as plantas convertem a luz em energia química sob a forma de açúcares que são depois distribuídos pelos vários órgãos da planta permitindo o seu correto crescimento e desenvolvimento. Contudo, condições desfavoráveis com impacto deletério nos processos de fotossíntese e respiração resultam, frequentemente, na diminuição dos níveis de energia celular da planta e afetam a alocação de açúcares para os órgãos em crescimento, levando à ativação da proteína cinase SnRK1. Esta, por sua vez, para restabelecer a homeostasia, ativa processos catabólicos e inibe processos anabólicos através da fosforilação de diversas enzimas metabólicas e de uma extensa reprogramação do transcriptoma, permitindo, assim, a aclimatação e sobrevivência das plantas. A SnRK1 pertence a uma família altamente conservada de cinases e partilha semelhanças estruturais e funcionais com as proteínas ortólogas “AMP-activated protein kinase” (AMPK), nos mamíferos, e “Sucrose non-fermenting 1” (SNF1), nas leveduras, funcionando como um complexo heterotrimérico composto por uma subunidade catalítica α e duas subunidades regulatórias, β e γ. Em Arabidopsis, existem três diferentes isoformas de SnRK1α, apesar de apenas duas (codificadas pelos genes SnRK1α1/KIN10 e SnRK1α2/KIN11) serem expressas constitutivamente em todos os tecidos da planta, três diferentes isoformas de SnRK1β (codificadas pelos genes SnRK1β1, SnRK1β2 e SnRK1β3) e apenas uma isoforma da subunidade γ, SnRK1βγ. Não obstante a sua enorme importância a nível da resposta a diferentes tipos de stress, a via de sinalização da SnRK1 vai além do mero ajuste metabólico nessas condições, estando igualmente implicada na sinalização de açúcares, associada a vias de sinalização mediadas por várias hormonas vegetais e envolvida na modulação do crescimento e desenvolvimento das plantas. Contudo, apesar do seu papel central, são poucos os mecanismos descritos, até à data, capazes de explicar a reprogramação transcripcional desencadeada pela SnRK1. O aumento da expressão de determinados genes, por seu lado, é atribuído em grande parte a fatores de transcrição “basic leucine Zipper” (bZIP) bem estabelecidos enquanto efetores a jusante da via de sinalização da SnRK1. Por outro lado, quanto à repressão de genes, os mecanismos subjacentes continuam maioritariamente desconhecidos, embora os microRNAs (miRNAs) tenham sido implicados na repressão de alguns dos alvos de SnRK1, ainda que através de mecanismos desconhecidos. Os miRNAs correspondem a uma classe de pequenos RNAs endógenos não codificantes com 20-24 nucleótidos que regulam a expressão de genes pós-transcricionalmente, através da clivagem e/ou do bloqueio da tradução de transcritos complementares. Desta forma, os miRNAs têm sido extensivamente implicados tanto no crescimento e desenvolvimento das plantas como na resposta a fatores de stress biótico e abiótico. O trabalho desenvolvido nesta tese de mestrado teve como principal objetivo aumentar o conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na comunicação entre a via de sinalização de SnRK1 e os miRNAs. Para isso, foram testadas duas hipóteses não mutuamente exclusivas: a) SnRK1 afeta a biogénese de miRNAs e b) SnRK1 afeta a atividade de miRNAs. A biogénese de miRNAs ocorre no núcleo, englobando várias processos interdependentes desempenhados por componentes organizados num complexo. Em linhas gerais, a RNA Polimerase II (Pol II) é recrutada para o gene MIR, promovendo a sua transcrição e dando origem a um miRNA primário (pri-miRNA) que é processado pela proteína “DICER-like 1” (DCL1) com o auxílio das proteínas “Hyponastic-leaves 1” (HYL1) e “Serrate” (SE), originando um percursor de miRNA (pré-miRNA). Este pré-miRNA é novamente processado pela DCL1, originando uma pequena cadeia dupla formada por miRNA/miRNA*, que constituem respectivamente a cadeia guia e a cadeia passageira. A extremidade 3’ do duplex miRNA/miRNA* é metilada pela metil-transferase “Hua-Enhancer 1” (HEN1). Ainda no núcleo, a cadeia passageira é normalmente alvo de degradação e a cadeia guia, que constitui o miRNA maduro, é reconhecida e incorporada no complexo “RNA-induced Silencing Complex” (RISC). Este complexo tem como principal efetor uma proteína da família “ARGONAUTE” (AGO), responsável pelo reconhecimento, já no citoplasma, de transcritos-alvo com sequência complementar à do miRNA, e pela sua subsequente clivagem ou bloqueio de tradução. Problemas na biogénese de miRNAs refletem-se, normalmente, num aumento de pri-miRNAs e numa acumulação deficiente de miRNAs maduros. Deste modo, para testar a primeira hipótese, comecei por analisar a acumulação de dois miRNAs específicos – miR156 e miR319 – em plantas Arabidopsis tipo silvestre e em mutantes com perda parcial de função de SnRK1. Os resultados mostraram que a inativação parcial de SnRK1 levou à redução dos níveis de expressão de ambos os miRNAs testados. Ainda que não se consiga apurar por agora se este é um efeito específico para os miRNAs testados ou se se trata de um mecanismo geral, a confirmar-se futuramente estes mesmos resultados para outros miRNAs, pode potencialmente significar que a atividade de SnRK1 é uma condição necessária para a correta acumulação de miRNAs. Para perceber se SnRK1 afeta a atividade de miRNAs, e com base em resultados preliminares do laboratório da Baena-González, procurei avaliar se SnRK1 poderia eventualmente estar a interagir com a proteína AGO1, o maior efector do complexo de silenciamento RISC. O correto reconhecimento dos miRNAs pela proteína AGO adequada e a sua subsequente incorporação no complexo RISC representa a etapa final da biogénese de miRNAs e é crítico para a sua interação com os respetivos transcritos-alvo. Em Arabidopsis, a família AGO é constituída por dez membros, mas os miRNAs são, na sua grande maioria, incorporados na AGO1. Assim, comecei por testar a interação física entre SnRK1 e AGO1 através de ensaios par-a-par de dois híbridos em levedura (“Yeast Two Hybrid” - Y2H) seguido de uma co-imunoprecipitação. Apesar de ter sido detetada uma interação positiva entre SnRK1α1 e AGO1 em levedura, através da co-imunoprecipitação não foi possível detetar interações entre as duas proteínas in planta em folhas maduras de roseta. Este resultado poderá ser talvez devido ao carácter transiente ou fraco da interação ou à sua ocorrência específica em determinados tecidos ou fases de desenvolvimento. No futuro, seria importante repetir esta experiência em tecidos ou condições em que a expressão de AGO1 seja mais elevada, eventualmente, otimizando ainda as condições da co-imunoprecipitação, para que se possa confiantemente descartar ou confirmar a ocorrência de interação física entre SnRK1 e AGO1 in planta. Paralelamente a esta abordagem bioquímica, procurei ainda perceber se existia alguma interação genética entre AGO1 e SnRK1. Para tal, mutantes ago1-27, deficientes no silenciamento pós-translacional de genes, foram cruzados com mutantes com ganho e perda de função de SnRK1α1. A interação genética foi avaliada com base na caracterização fenotípica dos processos de germinação e enverdecimento dos cotilédones na presença de elevados níveis de glucose ou ácido abscísico (ABA) e com base no tempo de floração em condições de dias longos. Relativamente à germinação e enverdecimento dos cotilédones, enquanto que, sob elevados níveis de glucose, a mutação ago1-27 parece potenciar a hipersensibilidade do sobreexpressor de SnRK1α1, sob elevadas concentrações de ABA é o sobreexpressor de SnRK1α1 que parece aumentar o fenótipo hipersensível do mutante ago1-27. Estes resultados sugerem uma possível regulação negativa de AGO1 sobre SnRK1 e vice-versa cuja intensidade e sentido podem variar consoante o tipo de stress. Curiosamente, a mutação snrk1α1-3 reverteu parcialmente o fenótipo de floração atrasado do mutante ago1-27, com o duplo mutante a florir em média dois dias antes do que as plantas ago1-27 e com menos folhas de roseta do que as plantas do tipo silvestre, reforçando ainda mais o potencial papel de AGO1 enquanto regulador negativo de SnRK1. Finalmente, para explorar a interação funcional entre SnRK1 e AGO1, desenvolvi importantes ferramentas genéticas baseadas numa linha repórter SUC::SUL que irão permitir, no futuro, testar até que ponto diferentes níveis de SnRK1 influenciam a atividade silenciadora de AGO1. No sistema repórter SUC::SUL, um RNA de cadeia dupla do gene SULPHUR, é expresso sob o controlo do promotor SUC2, específico das células de companhia do floema, dando origem a pequenos RNAs de interferência que são incorporados na AGO1, reprimindo, assim, o transcrito SUL (envolvido na biossíntese de clorofila) e causando a clorose das células silenciadas na vasculatura. Novas linhas de plantas homozigóticas para este repórter contendo diferentes mutações das subunidades catalíticas de SnRK1 foram geradas e estão prontas para ser usadas em ensaios futuros para os quais a configuração experimental foi também aqui otimizada. Em suma, os resultados apresentados nesta tese fornecem novas evidências que apontam para uma possível ação de SnRK1 em diferentes níveis de regulação sobre a via de sinalização dos miRNAs, nomeadamente na acumulação de miRNAs e na atividade de AGO1, para controlar o crescimento, desenvolvimento e respostas das plantas a stress. Estudos futuros serão necessários para confirmar a extensão e mecanismo de impacto de SnRK1 na biogénese de miRNAs e para dissecar em detalhe a interação com AGO1.As sessile organisms, plants are constantly exposed to environmental stresses that limit photosynthesis and/or respiration, thereby compromising ATP production, growth, and ultimately survival. To cope with these conditions, plants have evolved mechanisms that promote stress and defence responses at the expense of growth until the environmental conditions become favourable again. A core component of stress signalling pathways is the evolutionarily conserved sucrose non-fermenting 1 (SNF1)-related protein kinase 1 (SnRK1), the plant ortholog of yeast SNF1 and mammalian AMP-activated protein kinase (AMPK). SnRK1 is activated in response to declining energy levels during stress, implementing a vast metabolic and transcriptional reprogramming that restores homeostasis and thereby promotes plant survival. How SnRK1 regulates gene expression, and in particular how it exerts gene repression is poorly understood, but several lines of evidence suggest the involvement of microRNAs (miRNAs) in this process. miRNAs are 20–24nt non-coding RNAs that regulate gene expression posttranscriptionally mainly through cleavage and/or translation repression of complementary mRNA targets. MiRNAs have been extensively implicated in plant growth and development, but also in responses to environmental stress. SnRK1 has been shown to repress particular targets in a miRNA-dependent manner, suggesting that SnRK1 and miRNAs signalling pathways may be interconnected, even though the mechanisms underlying this connection are currently unclear. The aim of this thesis was to explore the mechanisms underlying this crosstalk by testing two non-mutually exclusive hypotheses: a) SnRK1 affects miRNA biogenesis and b) SnRK1 affects miRNA activity. To test the first hypothesis, I compared the levels of two specific miRNAs, miR156 and miR319, between wild-type Arabidopsis plants and SnRK1 partial loss-of-function mutants. Results showed that the partial inactivation of SnRK1 is accompanied by reduced levels of both miRNAs, suggesting that SnRK1 may be required for miRNA accumulation. To address whether SnRK1 affects miRNA activity and based on preliminary results from the Baena-González Lab, I asked whether SnRK1 could interact with ARGONAUTE 1 (AGO1), the major effector of the RNA-induced silencing complex (RISC). MiRNA activity is dependent on the correct loading of mature miRNAs into appropriate AGO proteins. In Arabidopsis, there are ten members of the AGO family, but most miRNAs are loaded into AGO1. I started by testing for a physical interaction between SnRK1 and AGO1 using yeast-two-hybrid (Y2H) pairwise assays, followed by co-immunoprecipitation from plant extracts. Results showed that SnRK1α1 physically interacts with AGO1 in yeast; on the other hand, by co-immunoprecipitation I was unable to detect in planta interactions between SnRK1α1 and AGO1 in mature leaves. However, to confidently discard or confirm a physical interaction in planta, it would be important to repeat the co-immunoprecipitation in tissues or conditions with higher AGO1 expression and, eventually, to optimise further the co-immunoprecipitation conditions. In parallel, I asked whether there were genetic interactions between AGO1 and SnRK1. For that, ago1-27 mutants were crossed to SnRK1α1 loss- and gain-of-function mutants and their genetic interaction was evaluated using both a phenotypic characterisation of early seedling development under increasingly high concentrations of glucose or ABA and a flowering time assessment in long day conditions. Regarding seedling development, ago1-27 enhances the hypersensitivity of the SnRK1α1 overexpressor (OE) to stress derived from high concentrations of glucose, whilst under high concentrations of ABA, SnRK1α1OE enhances the hypersensitive phenotype of ago1-27, suggesting that AGO1 and SnRK1 may negatively regulate each other. Moreover, the SnRK1 pathway seems to predominate under high sugar stress whilst AGO1 seems to be more important for ABA responses. Interestingly, the snrk1α1-3 mutation partially reverted the delayed flowering phenotype of ago1-27, further reinforcing that AGO1 is a negative regulator of SnRK1. Finally, to explore the functional interaction between SnRK1 and AGO1 in the future, I developed important genetic tools based on a SUC::SUL reporter line that will allow to test whether changes in SnRK1 levels and activity affect AGO1-mediated silencing activity. The SUC::SUL reporter is based on the vasculature-specific silencing of a gene involved in chlorophyll biosynthesis (SULPHUR), through small interfering RNAs derived from its sense and antisense expression under the SUC2 promoter. New plant lines for different snrk1α mutants harbouring this reporter were generated and are ready to be used in future assays, for which the experimental setup was also optimised here. Taken together, the results presented in this thesis suggest that SnRK1 may indeed regulate the miRNA pathway at different levels, affecting miRNA accumulation and potentially AGO1 function to control growth, development and plant stress responses. Further work will be required to confirm the extent and mechanism by which SnRK1 impacts on miRNA biogenesis and/or stability and to dissect the details of its interaction with AGO1.Baena González, ElenaSilva, Jorge Miguel Luz Marques da,1965-Repositório da Universidade de LisboaBarata, Diana Reis2019-02-05T19:06:17Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/36867TID:202192253enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T14:03:15Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/36867Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:01:26.492008Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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