Avaliação da Ação de um Vetor Multigénico de DNA Minicircular em Células Cancerígenas do Colo do Útero

• Main Author: Pereira, Diana Carvalho
• Publication Date: 2019
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Download full: http://hdl.handle.net/10400.6/10237
• topic: Células Cancerígenas Cervicais; Dna Minicircular; Mir-375; P53; Terapia Génica

O cancro é um grande problema de saúde global, contando com mais de 8 milhões de mortes por ano a nível mundial, sendo o cancro cervical a terceira malignidade mais comum com a infeção persistente por HPV de alto risco (HR-HPV) o fator principal para o seu desenvolvimento. O papilomavírus humano (HPV) é um vírus de DNA de cadeia dupla sendo os tipos de HR-HPV 16/18 os mais comuns que codificam para as oncoproteínas E6 e E7 e são responsáveis pela degradação e inativação das proteínas supressoras de tumor p53 e pRB, respetivamente. A terapia génica tem demonstrado grande potencial para o tratamento de várias doenças genéticas, induzindo a expressão do gene transferido a longo termo e com níveis elevados o suficiente para ter o efeito terapêutico desejado. Isto pode ser alcançado ao usar vetores inovadores de DNA minicircular (mcDNA): pequenos vetores de expressão nãovirais; para substituir os níveis de p53 e pRB. Os microRNAs (miRs) têm sido identificados como reguladores importantes da tumorigénese. Por exemplo tem sido descrito que o miR-375 tem a capacidade de silenciar as oncoproteínas E6 e E7 do HPV. Assim, o presente trabalho tem como objetivo a produção e purificação de quatro vetores de mcDNA: o mcDNA-vazio, o mcDNA-p53, o mcDNA-primiR-375 e o mcDNA-conjugado (com p53 e primiR-375), usando metodologias já descritas, para avaliar o efeito isolado de cada gene e o efeito do vetor multigénico, em comparação com o vetor vazio, por estudos de transfeção de células cancerígenas do colo do útero. Após os processos de fermentação e conversão do mcDNA a partir do seu percursor de plasmídeo parental (PP) induzida por L-arabinose, mostrou-se que a forma mais rentável de purificar os vetores de mcDNA seria por cromatografia de exclusão molecular, utilizando uma coluna de 60 cm para separar o mcDNA-vazio e o mcDNAprimiR375, uma de 90 cm para o mcDNA-p53 e o mcDNA-conjugado e para todos um caudal de 0,3 mL/min. Para perceber qual o melhor tipo de células a ser utilizado foi feita uma comparação dos níveis dos transcritos de E6 m células Hela, SiHa e Caski por RT-PCR e verificou-se que nas células CaSki os níveis de E6 eram mais elevados. Assim, após a transfeção, estudos de viabilidade celular e proliferação em fibroblastos humanos (FibH) e células cancerígenas CaSki indicaram que os vetores terapêuticos não apresentaram toxicidade para os FibH, mas reduziram a viabilidade nas células CaSki com efeito mais pronunciado nos vetores mcDNA-p53 e mcDNA-conjugado. Além disso verificou-se por RTqPCR que os níveis dos transcritos de p53 aumentaram e os de E6 e E7 diminuíram após 24 h nas células transfetadas com os vetores terapêuticos.