Deteção da suscetibilidade antimicrobiana por citometria de fluxo diretamente a partir de amostras de urina infetadas - Oliveira, Joana Rita dos Santos (2018)
As infeções do trato urinário são das infeções mais comuns em todo o mundo, sendo provocadas maioritariamente por bactérias, nomeadamente por bacilos Gram-negativo. O diagnóstico microbiológico destas infeções demora pelo menos 48 horas, obrigando à instituição de terapêutica empírica que nem sempre é a mais adequada. Neste estudo, pretendeu-se desenvolver um método rápido para determinar a suscetibilidade aos antibacterianos por citometria de fluxo, diretamente a partir de amostras de doentes com ITU, de modo a permitir a instituição da terapêutica adequada à situação clínica. Para tal, começou-se por validar os kits da FASTinov® gramneg para avaliação da suscetibilidade aos antimicrobianos, previamente desenvolvidos, em urinas inoculadas com estirpes padrão. Procedeu-se à seleção das amostras clínicas de urina, positivas para bacilos Gram-negativo, utilizando o citómetro de fluxo Sysmex UF-1000i e avaliando a sua acuidade. Nestas amostras positivas otimizou-se um protocolo de extração dos microrganismos de forma a obter uma suspensão pura e com concentração bacteriana suficiente para iniciar a inoculação do kit (0,5 McFarland). A partir desta suspensão foi realizada a identificação do microrganismo por espetrometria de massa, MALDI-TOF. No fim, foi realizada uma prova de conceito em 10 amostras clínicas positivas no screening efetuado pelo Sysmex UF-1000i, procedendo-se à sua identificação e à determinação do perfil de suscetibilidade pelos métodos descritos anteriormente. Os resultados foram comparados com o método de rotina. Relativamente ao kit FASTinov® gramneg obteve-se uma proporção de concordância de 92,7% e 92,0% para os protocolos EUCAST e CLSI, respetivamente quando comparado com os métodos clássicos. Na avaliação do Sysmex UF-1000i verificou-se que houve diferenças estatisticamente significativas (p = 0,044) entre a contagem do equipamento e a determinação de UFC, mas essas não excederam um logaritmo (bactérias/mL). Sendo assim, o Sysmex UF-1000i mostrou ser promissor na seleção das amostras positivas para bacilos Gram-negativo. Na identificação dos microrganismos diretamente a partir da urina usando a espetrometria de massa MALDI-TOF houve uma boa concordância com a identificação pelos métodos de rotina sendo a espécie predominante Escherichia coli. Na prova de conceito 10 amostras clínicas foram identificadas como Escherichia coli (30 %), Klebsiella pneumoniae (30 %), Proteus mirabilis (30 %) e os restantes 10 % como Enterobacter cloacae. Verificou-se uma proporção de concordância entre o kit FASTinov® gramneg e os métodos de rotina de 95,0% para o protocolo EUCAST (protocolo utilizado nos laboratórios Portugueses). Com este trabalho, foi possível criar um método diagnóstico rápido (cerca de 2 horas) combinando o screening das amostras de urina pelo Sysmex UF-1000i, a identificação do microrganismo por MALDI-TOF e a determinação da suscetibilidade antimicrobiana por citometria de fluxo usando o kit FASTinov® gramneg, possibilitando o tratamento dirigido. No entanto, mais estudos devem ser realizados para comprovar os resultados obtidos