Avaliação da pureza das sub-populações celulares linfocitárias para monitorização do quimerismo nos doentes pós-transplante hematopoiético - Dias, Mónica Assunção (2017)
Nos doentes submetidos a transplante hematopoiético alogénico, a monitorização do quimerismo é importante na avaliação do sucesso do transplante. A análise de quimerismo nas diferentes sub-populações linfocitárias possibilita a monitorização em linhagens específicas, podendo estar dependente da pureza das células isoladas. A pureza das sub-populações celulares pode ser avaliada por técnicas moleculares ou por citometria de fluxo. Recentemente foram desenvolvidos kits baseados em técnicas de biologia molecular, tal como o Non-T Genomic Detection Kit e o Non-B Genomic Detection Kit da Accumol, que detetam a presença de ácido desoxirribonucleico (ADN) de células contaminantes em amostras de ácido desoxirribonucleico genómico de linfócitos T ou B isolados. Este estudo teve como objetivo avaliar a pureza das sub-populações linfocitárias, T e B, importantes na monitorização do quimerismo. As amostras de linfócitos T e B foram isoladas por meios imunomagnéticos, separação direta e separação sequencial, procedendo-se de seguida à extração de ácido desoxirribonucleico. A amplificação dos Short Tandem Repeats foi realizada através da técnica de reação em cadeia da polimerase multiplex e os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese capilar. Na avaliação da pureza por citometria de fluxo os anticorpos utilizados na marcação foram CD45+, CD3+ e CD19+, os resultados foram analisados com o software Navios. A avaliação da pureza com o kit Accumol realizou-se nas amostras extraídas anteriormente para o estudo do quimerismo, de seguida amplificaram-se os fragmentos por reação em cadeia da polimerase e respetiva separação por eletroforese capilar, a análise foi efetuada no software GeneMapper. No presente estudo, foram analisadas 31 amostras provenientes de doentes alo-transplantados. No isolamento de linfócitos T por separação direta, 53% das amostras apresentaram contagem absoluta de células ≥400 células/μL e pureza >90%. Após o isolamento direto de linfócitos B, não foram obtidas amostras com contagens absolutas de células ≥400 células/μL e purezas >90%. No isolamento por separação sequencial, verificou-se contagem absoluta de células ≥400 células/μL e pureza >90% em 77% das amostras de linfócitos T e em 8% amostras de linfócitos B. A maioria das amostras de linfócitos T com quimerismo completo e misto, apresentaram pureza >90%. Nos linfócitos B, com quimerismo completo e quimerismo misto, a percentagem da pureza foi variável. Com este estudo, pode-se concluir que com contagens linfocitárias ≥0,5x103/μL no sangue periférico é possível obter uma contagem absoluta de células ≥400 células/μL, assim como valores de pureza >90%, principalmente no isolamento de sub-populações de linfócitos T. O mesmo não se verificou nas amostras de linfócitos B, pois a maioria não atingiu valores de contagem absoluta de células ≥400 células/μL e de pureza >90%. Para o isolamento de linfócitos T e B numa amostra de sangue, a separação sequencial apresentou melhores resultados na obtenção de amostras com contagem absoluta de células ≥400 células/μL e de pureza >90%.