Genes ompL1 e lipL32 como marcadores de leptospiras patogénicas - importância no diagnóstico da leptospirose - SOUSA, Márcia Filipa Dias (2019)
A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial causada por espiroquetas do género Leptospira que afeta mais de um milhão de casos/ano. As leptospiras são disseminadas no ambiente, sobretudo pela urina dos roedores, que são os principais reservatórios desta bactéria. Em Portugal, o Arquipélago dos Açores, constitui uma região endémica com uma elevada incidência anual, representando um problema de Saúde Pública. Assim, os objetivos deste trabalho foram: i) caracterizar a patogenicidade de culturas (isolados) de Leptospira spp., previamente obtidos de roedores capturados nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), através de uma abordagem polifásica (ao nível fenotípico e molecular), esta última focada na deteção dos genes ompL1 e lipL32; e ii) determinar o interesse destes genes no diagnóstico laboratorial da leptospirose. Para tal, foram selecionadas (N=100) isolados de Leptospira spp., preservados a -80ºC no IHMT. Fez-se novo cultivo em meio seletivo EMJH cujo crescimento foi acompanhado ao longo de, pelo menos, três meses. A caracterização da patogenicidade foi realizada através de testes de crescimento [a 13ºC, e com a adição ao meio de cultura de 8-azaguanina (225μg/mL)], e um teste morfológico com adição de NaCl (1M). A identificação do sorogrupo/sorovar (sv.) de cada isolado foi realizada através de aglutinação microscópica, usando anticorpos monoclonais (mAbs). O estudo molecular de alguns isolados (n=32; 14 em cultura e DNA dos restantes), iniciou-se com a extração de DNA genómico, seguida de amplificação, usando dois protocolos de PCR convencional desenvolvidos e otimizados, no decurso do presente trabalho, utilizando primers com base nos genes lipL32 e ompL1, presentes em espécies patogénicas de Leptospira. O protocolo baseado no gene lipL32, foi também utilizado em amostras de doentes (N=127), urina (nu=99) e soro (ns=28). Adicionalmente, quatro dos isolados de Leptospira e algumas amostras humanas (nu=11 e ns=5) foram testadas por nested-PCR, utilizado na rotina. O DNA amplificado de alguns isolados e amostras humanas foi sequenciado e analisado por BLAST. Observou-se crescimento bacteriano em (n=14+/100) isolados cuja caracterização fenotípica revelou serem patogénicos. A avaliação com os mAbs permitiu incluí-los em dois sorogrupos distintos: Ballum (sv. Arborea) e Icterohaemorrhagiae (sv. Copenhageni). O protocolo “lipL32” revelou a presença de DNA leptospírico, no total dos isolados testados (n=32), enquanto que o protocolo “ompL1” detetou DNA específico em 84% (n=27+/32). Ambos os protocolos mostraram uma elevada especificidade, tendo o primeiro mostrado sensibilidade até 100bact/mL. Os resultados da sequenciação confirmaram que todas as amostras analisadas (isolados murinos e humanas) eram espécies patogénicas de Leptospira. Assim, os dados obtidos permitiram: i) conhecer a patogenicidade dos isolados estudados ao nível fenotípico e molecular; ii) corroborar a prevalência de leptospiras dos sorogrupos Ballum e Icterohaemorrhagiae, sendo estes os que mais afetam a população Açoriana, o que é concordante com estudos anteriores para a mesma região e país; iii) confirmar que os sorogrupos Ballum e Icterohaemorrhagiae têm um forte tropismo para determinadas espécies de roedores, em particular para Mus musculus e Rattus norvegicus, respetivamente; iv) otimizar o protocolo de PCR com base no gene lipL32, tornando-o uma nova ferramenta muito útil quer em estudos epidemiológicos (nos roedores), quer em amostras clínicas, melhorando significativamente o atual diagnóstico molecular da leptospirose.