Caracterização bioquímica e funcional de complexos proteicos associados ao 3'UTR de mRNAs alvo

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Main Author: Oliveira, Mariana Colino de
Publication Date: 2010
Format: Master thesis
Language: por
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/10451/5516
Summary: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
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spelling Caracterização bioquímica e funcional de complexos proteicos associados ao 3'UTR de mRNAs alvo3'UTRASF/SF2Estabilidade de mRNAsHnRNP KRBPsSMASRp20Teses de mestrado - 2010Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Recentemente, tem sido consolidada a ideia de que os mecanismos pós- transcricionais Apresentam um importante papel na regulação da expressão génica, sendo as RNA-binding proteins (RBPs) um dos seus principais mediadores. Neste trabalho estudaram-se interacções mRNA-proteína em dois contextos diferentes: na resposta imunitária inata e numa doença genética. No primeiro estudo, em colaboração com a UBCSI do IMM, pretendeu-se averiguar se em resposta à estimulação de células THP-1 com E. coli ocorre interacção entre a hnRNP K e os transcritos das proteínas ASF/SF2 e SRp20, cuja actividade inibe a libertação da Interleucina-1β. Por imunoprecipitação da hnRNP K e qRT-PCR dos transcritos, em consequência da estimulação, observou-se a formação dos referidos complexos RNA-proteína. Adicionalmente, apesar dos resultados inconclusivos para o ASF/SF2, observou‐se que a interacção entre a hnRNP K e o transcrito do SRp20 depende da activação da via MAPK/ERK. A Atrofia Muscular Espinal (SMA) é uma doença autossómica recessiva causada pela perda de função do gene SMN1, o qual codifica a proteína SMN. Todos os doentes expressam o SMN2 que, embora insuficiente para compensar a perda do SMN1, também leva à produção de SMN. Dado que quanto maior o número de cópias SMN2, menor a severidade da SMA, esta constitui uma forte candidata à aplicação de terapias que aumentem a expressão da SMN por aumento da estabilidade do transcrito SMN2. Consequentemente, é necessário identificar os factores envolvidos na modelação da sua estabilidade, nomeadamente RBPs, pelo que se teve como objectivo a identificação de proteínas de ligação ao seu 3’UTR (pois contêm, maioritariamente, as sequências modeladoras da estabilidade dos mRNAs). As proteínas identificadas por espectrometria de massa foram a NUBPL, LARP1, LARP2, LARP4 e hnRNPG, que se prevêem ou já estão caracterizadas como tendo actividade de ligação a nucleótidos e de controlo pós-transcricional, constituindo candidatos interessantes a reguladores da expressão da SMN.RNA-binding proteins (RBPs) are one of the main players in post‐ transcriptional control. The main goal of this project was to characterize mRNA-RBP interactions in two different contexts: the immune innate response and a genetic disease, the Spinal Muscular Atrophy (SMA). The UBCSI lab, from IMM, found that ASF/SF2 and SRp20 proteins inhibit IL‐1β secretion, besides evidence of hnRNP K influence on ASF/SF2 and SRp20 expression. Jointly with the UBCSI lab, we hypothesized that hnRNP K interaction with ASF/SF2 and SRp20 transcripts on THP‐1 cells Occurred in response to E. coli stimulation, and further assessed the possible role of hnRNP K as a post‐ transcriptional regulator of these mRNA‐targets. As a result of E. coli stimulation, mRNP complexes between hnRNP K and both transcripts were detected (using qRT‐ PCR after immunoprecipitation). Although an interaction with SRp20 was observed to be dependent on MAPK/ERK pathway activation, data for ASF/SF2 was inconclusive. SMA is an autossomal recessive neuromuscular disease caused by the loss of function of the SMN1 gene, which codes for the SMN protein. All patients express SMN2, which also codes for SMN, although at insufficient levels to compensate for SMN1 loss. The disease severity is inversely proportional to SMN2 copy number, which makes SMA a strong candidate for the application of therapeutic approaches leading to increased mRNA stability, and thus of higher SMN levels. We proposed to identify the factors involved in SMN2 transcript stabilization, namely RBPs. Since 3’UTRs are transcript regions involved on mRNA stability control, we looked for RBPs that bound to the 3’UTR of SMN2. Using mass spectrometry we identified several potential binding proteins: NUBPL, LARP1, LARP2, LARP4 e hnRNP G. These proteins are predicted or have been characterized as having nucleotide-binding activity and a role on post-transcriptional regulation, making them good candidates to bind and modulate SMN2 transcript stability.Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-Farinha, Carlos Miguel Ribeiro da Silva, 1973-Repositório da Universidade de LisboaOliveira, Mariana Colino de2012-03-12T11:13:11Z20102010-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/5516porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T12:50:53Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/5516Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T02:29:10.081322Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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