Estudo do papel do gene Rv1358 no estabelecimento e maturação dos biofilmes formados por bactérias do complexo Mycobacterium Tuberculosis

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Main Author: Vaz, Marta Helena Melo de Campos e Cunha
Publication Date: 2016
Format: Master thesis
Language: por
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
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Summary: Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
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spelling Estudo do papel do gene Rv1358 no estabelecimento e maturação dos biofilmes formados por bactérias do complexo Mycobacterium TuberculosisMycobacterium bovisTuberculoseBiofilmesStresse oxidativo e nitrosativoRv1358Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016A tuberculose é uma doença infeciosa de etiologia bacteriana, com uma incidência anual média superior a 9 milhões de casos e tendo sido associada à morte de 1.5 milhões de indivíduos só em 2014. Dentro do género Mycobacterium, o complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC) engloba várias espécies patogénicas, fenotipica e genotipicamente relacionadas, nomeadamente Mycobacterium tuberculosis, o principal agente etiológico da tuberculose humana, e M. bovis, o agente da tuberculose bovina. A interação entre M. tuberculosis e os macrófagos é um processo complexo que determina a evolução da infeção. Esta interação é influenciada por múltiplos fatores, tais como o genótipo da micobactéria, o genótipo do hospedeiro, e também por fatores ambientais. Uma vez dentro do fagossoma, e após impedir a fusão com o lisossoma, as micobactérias estabelecem-se no interior dos macrófagos, onde são capazes de sobreviver, ainda que expostas a variados stresses, nomeadamente oxidativo e nitrosativo. Os modelos atuais de persistência micobacteriana mencionam a presença de populações de células latentes que reativam mediante imunossupressão do hospedeiro. O fenótipo de latência caraterístico da infeção causada por M. tuberculosis, com menor taxa de replicação intracelular, resistência a compostos antimicrobianos e proteção a agressões ambientais em resultado do enclausuramento e compartimentação das micobactérias no granuloma, apresenta semelhanças com o fenótipo exibido por células organizadas em biofime. Os biofilmes maduros fornecem microambientes adequados ao desenvolvimento de uma subpopulação persistente de células tolerantes a stresses xenobióticos. Recentemente, foi sugerido que M. tuberculosis necessita de um ambiente e programa genético específicos para formar comunidades biológicas com elevado grau de organização, que possam conter células tolerantes a agentes antimicrobianos no interior de uma estrutura rica em ácidos micólicos livres. No entanto, estão ainda reunidas escassas evidêncas experimentais que identifiquem inequivocamente os determinantes ambientais e genéticos associados ao processo de formação de biofilme, sendo também reduzida a informação neste âmbito no que se refere a M. bovis. Neste trabalho, procurou-se determinar as condições ambientais que favorecem a formação de biofilmes por bactérias do complexo M. tuberculosis. Testou-se também a hipótese de que a limitação de oxigénio e a exposição aos stresses oxidativo e nitrosativo encontrados por micobactérias enclausuradas nos granulomas poderão desencadear uma resposta de crescimento associado a biofilme. O processo de quorum sensing, resultante da acumulação de moléculas sinalizadoras que privilegiam a comunicação intra- e intercelular, envolve a regulação de genes que controlam atividades que são benéficas quando realizadas por um grupo de bactérias que atuam em sincronia, como o processo de formação de biofilmes. A análise comparativa de genomas de micobactérias sugere que o gene Rv1358 seja um possível regulador transcricional da família LuxR, a qual inclui proteínas de outros microrganismos que se sabe estarem envolvidas na regulação da expressão génica dependente de fenómenos de densidade celular. A análise efetuada por pesquisa de homologia nas bases de dados dos domínios funcionais da proteína Rv1358 indica que, além do domínio LuxR, existe uma região associada à atividade de adenilato ciclase, pelo que se presume que a proteína resultante exerça atividade reguladora da expressão génica em resposta a estímulos ambientais específicos. A análise comparativa, neste trabalho, de 26 genomas de M. bovis e 52 genomas de M. tuberculosis, que se encontram disponíveis nas bases de dados internacionais, demonstrou que, apesar de se detetarem algumas variações nucleotídicas e aminoacídicas, a sequência desta região codificante apresenta elevado grau de conservação entre as estirpes de M. bovis. No entanto, nas estirpes de M. tuberculosis existe uma maior variação, com acumulação de polimorfismos de nucleótido único (SNPs), inserções e eliminações. Estes polimorfismos são mais frequentes nos domínios de adenilato cliclase e de ATPase. No caso do domínio de adenilato ciclase, os polimorfismos estão presentes sobretudo em M. bovis, especulando-se que possa resultar de uma pressão evolutiva para melhorar a resposta a estímulos ambientais. A modelação da estrutura tridimensional da proteína de estirpes que apresentavam polimorfismos em domínios funcionais teve como objetivo avaliar as presumíveis consequências estruturais e funcionais dos polimorfismos identificados, verificando-se que as alterações mais frequentes provocam um rearranjo tridimensional distinto, com alteração espacial e posição distal dos domínios de ATPase e LuxR, o que sugere consequências funcionais nas interações moleculares da proteina em estudo com outras proteínas e substratos/ligandos e, consequentemente, na sua atividade biológica. A partir do alinhamento dos genomas de M. bovis e M. tuberculosis analisados, foram construídos cladogramas para avaliar a microevolução do gene Rv1358 nestes dois ecotipos. Os resultados obtidos sugerem diferentes padrões microevolutivos deste gene nos membros do complexo M. tuberculosis, o que possivelmente reflete a adaptação específica do agente etiológico humano e bovino aos respetivos hospedeiros e também a adaptação biogeográfica das estirpes analisadas. Acresce ainda que, em M. tuberculosis, parece existir um cenário de pseudogeneização, sugerido pela acumulação de numerosas mutações no gene Rv1358, algumas causando disrupção dos seus domínios reguladores e destruindo o potencial de codificação de uma proteína funcional. Da análise bioinformática realizada, constatou-se ainda a possibilidade do gene Rv1358 ter um local alternativo de transcrição, que não a partir do promotor canónico, com local de ligação de sigF a meio do gene (promotor intragénico). Isto originará a transcrição de um mRNA truncado: a análise in silico da sequência traduzida do transcrito intragénico dependente de sigF indica a formação de uma proteína deficitária em cerca de 250 resíduos na extremidade N-terminal, que corresponde à eliminação do domínio de adenilato ciclase. Se existem duas formas funcionais da proteína Rv1358 é atualmente ainda desconhecido. Por outro lado, especulamos que a produção de um RNA não codificante resultante da transcrição parcial da sequência de DNA codificante (CDS) em análise possa igualmente exercer efeitos regulatórios em trans. Neste trabalho, realizou-se também o crescimento em descontínuo de M. smegmatis mc2 155, M. bovis BCG Tokyo, e de quatro estirpes de campo de M. bovis (I, II, III, IV) em meio Middlebrook 7H9 modificado, com o objetivo de se caraterizar a resposta fisiológica e transcricional destas estirpes a condições ambientais in vitro que mimetizam o microambiente do hospedeiro, tais como stresses oxidativo, nitrosativo e a presença de colesterol. Para determinar e comparar a resposta fisiológica das várias estirpes após exposição às condições impostas, foram determinadas as absorvâncias a 590 nm das frações celulares aderidas a superfícies e coradas com violeta de cristal; contagem do número de células viáveis; cálculo da sobrevivência; e cálculo das taxas específicas de crescimento. Para M. smegmatis mc2 155 e M. bovis BCG Tokyo, relativamente aos compostos que causam stresse oxidativo (peróxido de hidrogénio, ácido cítrico, ácidico ascórbico e metil de viologénio), registaram-se diferenças extremamente significativas (p<0.001) na capacidade de formação de biofilmes na presença de 9 mM H2O2, 15 mM de ácido ascórbico e 150 μM de metil de viologénio, quando comparada com o controlo, acompanhada de uma diminuição drástica da sobrevivência, em mais de 50%. Na presença de 10 mM de ácido cítrico verificam-se diferenças significativas (p<0.05). Na presença de ácido cítrico e ácido ascórbico, observa-se preferencialmente a formação de biofilme na parte inferior, no poço, mas não em suspensão, o que contrasta com as observações na presença de outros compostos. O nitrito de sódio (NaNO2) e o nitroprussiato de sódio (NPS) foram testados por gerarem stresse nitrosativo. Na presença de uma concentração de 25 mM de NaNO2, ocorrem diferenças extremamente significativas (p<0.001) na formação de biofilme e a sobrevivência da população reduz para 50%. Na presença de nitroprussiato de sódio, verificam-se os valores mais elevados de biofilme registados neste trabalho, por comparação com o controlo, com diferenças extremamente significativas (p<0.001) em resposta a uma concentração de 25 mM de NPS. A baixa sobrevivência na presença deste composto, concomitante com um aumento da quantidade de células aderidas, sugere que o stresse gerado possa favorecer uma resposta de crescimento em biofilme. Na presença de colesterol, não existem diferenças significativas entre o controlo (com Tween80®) e a condição em teste, nas várias estirpes estudadas. Também foi estudada a influência de cloreto de sódio na formação de biofilmes, verificando-se que, na presença de 3% de NaCl, ocorrem diferenças extremamente significativas (p<0.001), com uma menor formação de biofilme na presença de stresse salino e com valores de sobrevivência inferiores a 20%. Nas estirpes virulentas de M. bovis, a presença de 9 mM de H2O2 ou de 25 mM de NaNO2 causa também uma diminuição do biofilme formado, com diferenças extremamente significativas (p<0.001). Também nas estirpes M. bovis I e II, o composto NPS é o único em cuja presença se verificam valores mais elevados de biofilme, apresentando diferenças extremamente significativas (p<0.001) relativamente ao controlo. Na presença de colesterol, não se registam diferenças significativas. O perfil transcricional do gene Rv1358 e sigF nas condições de stresse estabelecidas, estudadas nas duas estirpes de campo de M. bovis (I e II) apresentou diferenças, sugerindo respostas transcricionais individuais, com um perfil estirpe-dependente, aos estímulos ambientais estudados. Verifica-se a sub-expressão dos genes Rv1358 e sigF em quase todas as condições ambientais de stresse estudadas. Destaca-se em particular o efeito exercido pelo ácido ascórbico que induz um comportamento celular e transcricional distinto, dependendo da estirpe estudada: a expressão transcricional relativa de Rv1358 e de sigF encontra-se aumentada nove e oito vezes, respetivamente, em M. bovis I, mas diminuída em M. bovis II. A construção de um mutante de eliminação por uma estratégia de transdução especializada para se estudar o papel do gene Rv1358 na fisiologia micobacteriana foi delineada e avançada, tendo-se obtido a construção de um fagemídeo com as regiões a montante e jusante de Rv1358 clonadas. Após construção do mutante, a ser concluída no futuro, será efetuada uma análise funcional e fenotípica do mesmo, por comparação com os resultados obtidos com a estirpe selvagem, dando-se assim um contributo para a análise funcional de genes do complexo M. tuberculosis e, particularmente, para aferir a importância deste gene na resposta a stresses ambientais caraterísticos do hospedeiro. Por fim, a confirmar-se, no futuro, que Rv1358 sofreu um processo de pseudogenização em M. tuberculosis, deverá ser explorada a sua transcrição ativa em diferentes condições fisiológicas e a possibilidade do transcrito exercer um efeito regulatório, nomeadamente sobre o seu gene parental.Tuberculosis is an infectious disease of bacterial etiology, with an average annual incidence of over 9 million cases, and to the death of 1.5 million people in 2014 alone. Within the genus Mycobacterium, the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) comprises several phenotypically and genotypically related pathogenic species, including Mycobacterium tuberculosis, the main etiological agent of human tuberculosis, and M. bovis, the agent of bovine tuberculosis. The interaction between M. tuberculosis and macrophages is a complex process that determines the progression of the infection. This interaction is influenced by multiple factors, including the bacterium genotype, the genotype of the host, as well as by environmental factors. Once inside the phagosome, and after preventing its fusion with the lysosome, mycobacteria settle within macrophages, being able to survive even if exposed to different stress conditions, such as oxidative and nitrosative stress. Current models of persistent mycobacterial infection suggest the existence of latent cell populations that have the ability to reactivate upon immunosuppression of the host. Asymptomatic latency and persistence, associated to a dormant and non-replicating state of infecting microorganisms displaying antibiotic resistance, is a hallmark of M. tuberculosis infections in humans that has similarities to the phenotype exhibited by microbial biofilms. Mature biofilms provide microenvironments that are suitable for the development of a persistent subpopulation of xenobiotic-tolerant cells. Recently, it has been suggested that M. tuberculosis requires a specific environment and genetic program to form biological communities exhibiting a high degree of organization, which may contain antimicrobial-tolerant cells within a structure rich in free mycolic acids. However, there are still scarce experimental evidences regarding the unambiguous identification of the genetic and environmental determinants associated with biofilm formation, which holds particularly true in the case of M. bovis for which little information is currently available. In this work, we tried to determine which environmental conditions favor biofilm formation by M. tuberculosis complex bacteria. In addition, we also tested the hypothesis that oxygen limitation and exposure of granuloma-enclosed mycobacteria to nitrosative and oxidative stress may elicit a biofilm growth response. Quorum sensing is an intra- and intercellular communication process, resulting from the accumulation of signaling molecules that interfere with the regulation of genes controlling activities that are beneficial when carried out by a group of bacteria acting in synchrony, such as the process of biofilm formation. The comparative analysis of mycobacterial genomes suggests that Rv1358 gene is a possible transcriptional regulator of the LuxR family, which includes proteins from other microorganisms that are known to be involved in cell density-dependent regulation of gene expression. The analysis of the functional domains of Rv1358 protein, performed through homology searches in online databases, indicates adenylate cyclase activity in addition to the LuxR domain, which together suggest that this protein may regulate gene expression in response to specific environmental stimuli. The comparative analyses, performed in this study, of 26 M. bovis and 52 M. tuberculosis genomes that are available in international databases, and using M. tuberculosis H37Rv genome as reference, shows that, even though some nucleotide and aminoacid variation is found, this coding DNA sequence (CDS) exhibits a high degree of conservation across M. bovis strains. However, M. tuberculosis strains exhibit marked variations, accumulating single nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in this CDS. The majority of these polymorphisms are present in the cyclase and ATPase domains. In the particular case of the adenylate cyclase domain, the polymorphisms are present mainly in M. bovis, which might be a result of evolutionary pressure to improve the response to environmental stimuli. Modeling of the three dimensional structure of the protein from strains that exhibited polymorphisms in functional domains was carried out to evaluate their potential structural and functional consequences. The most frequent changes detected originated a distinct three-dimensional rearrangement, with changes in spatial and distal positions of LuxR and ATPase domains, suggesting functional consequences on the molecular interactions of this protein with other substrates/ligands and hence on its whole biological activity. Cladograms were inferred from the alignments of the genomes of M. bovis and M. tuberculosis, in order to evaluate the microevolution of the Rv1358 gene in these two ecotypes. The results suggest the existence of different micro-evolutionary patterns of this gene in M. tuberculosis complex members, which possibly reflects specific adaptation of human and cattle bacilli to their respective hosts, as well as the biogeographical adaptation of analyzed strains. Furthermore, in M. tuberculosis, the existence of a pattern of pseudogenization is suggested by the accumulation of numerous mutations in Rv1358, some leading to the disruption of its regulatory domains and destroying its potential to encode a functional protein. Our bioinformatic analysis also suggests an alternative transcription site, other than the canonical promoter, evidenced by the presence of a consensus sequence for sigF alternative sigma factor in the middle of Rv1358 (intragenic promoter). Transcription from this alternative site is expected to originate a truncated mRNA: the in silico analysis of the translated sequence of the sigF-dependent, intragenic transcript, predicts the formation of an incomplete protein, lacking approximately 250 residues at the N-terminus, which corresponds to the elimination of the adenylate cyclase domain. If there are two functional forms of Rv1358 protein is currently unknown. Moreover, we hypothesize that the production of a non-coding RNA transcript resulting from the partial CDS in question may also exert trans-acting regulatory effects. In this work, batch culture growth of M. smegmatis mc2 155 and M. bovis BCG Tokyo, and four field strains of M. bovis (I, II, III, IV), was carried out in modified Middlebrook 7H9 in order to characterize the in vitro physiological and transcriptional responses of these strains to environmental conditions mimicking host microenvironment, such as oxidative and nitrosative stresses and the presence of cholesterol. To compare the physiological responses of various strains following exposure to the imposed conditions, several parameters were determined: the absorbance at 590 nm of crystal violet-stained, surface-adherent, cell fractions; the viable cell count; the survival rate; and the specific growth rates. For M. smegmatis mc2 155 and M. bovis BCG Tokyo, the presence in growth media of compounds that cause oxidative stress (hydrogen peroxide, citric acid, ascorbic acid and methyl viologen), exerted highly significant differences (p <0.001) in biofilm formation, specifically in the presence of 9 mM H2O2, 15 mM ascorbic acid or 150 mM of methyl viologen, causing a decrease in survival of over 50%; 10 mM citric acid caused significant differences (p <0.05) in comparison with 7H9 control. When cells were grown in the presence of citric acid and ascorbic acid, biofilm formation is observed on the bottom of the well, but not in suspension, which contrasts with our observations when other compounds are tested. Sodium nitrite (NaNO2) and sodium nitroprusside (SNP) were tested because of their capacity to generate nitrosative stress. At a concentration of 25mM NaNO2, there are very significant differences (p <0.001) on biofilm formation and survival of the population is reduced by 50%. In the presence of SNP, the highest values of biofilm are obtained, when compared to the control, with highly significant differences (p <0.001) occurring in response to a concentration of 25 mM. The low survival in the presence of this compound, together with the concomitant increase in the number of adherent cells, suggests that nitrosative stress may promote biofilm growth. In the presence of cholesterol, there are no significant differences between the control and the tested condition, for the various strains under study. The influence of sodium chloride in biofilm formation was also studied. Growth under the presence of 3% NaCl induced very significant differences (p <0.001), leading to a reduction in biofilm formation and to less than 20% cell survival. In M. bovis virulent strains, the presence of 9 mM H2O2 or 25mM NaNO2 in growth media decreases biofilm, with highly significant differences (p <0.001) being observed. Also in M. bovis strains I and II, NPS is the only compound where higher values of biofilm are achieved in the presence of stress, with highly significant differences (p <0.001) compared to the control condition. In the presence of cholesterol, there are no significant differences. The transcriptional profiling of Rv1358 and sigF genes was established in two field M. bovis strains (I and II), indicating strain-dependent transcriptional responses to different environmental stimuli. Sub-expression of Rv1358 and sigF was observed in most of the environmental stress conditions studied. It's important to highlight ascorbic acid effect, which induces a different transcriptional response depending on the tested strain: the expression of Rv1358 and sigF is increased nine- and eight-fold, respectively, in M. bovis I, but is reduced in M. bovis II. The construction of a deletion mutant using a specialized transduction strategy was delineated and advanced in this work in order to study the role of the Rv1358 in mycobacterial physiology. The construction of a phagemid in which the upstream and downstream regions of Rv1358 were cloned was successful. After completion, in the future, of mutant construction, functional and phenotypic comparative analyses of the mutant versus wild type strain will be enabled, thus giving an important contribution to the functional analysis of M. tuberculosis complex genes and, in particular, to assess the importance of this gene in response to several environmental stresses characteristic of the host. Finally, to further confirm in the future that Rv1358 has suffered pseudogenization in M. tuberculosis, its active transcription in articulation with the transcriptome of MTC should be determined and the potential ability of the transcript to exert a regulatory effect in different physiological conditions, namely over its parental gene, should be explored.Cunha, Mónica VieiraRepositório da Universidade de LisboaVaz, Marta Helena Melo de Campos e Cunha2016-04-27T11:05:46Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/23542TID:201172658porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T13:28:36Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/23542Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T02:45:25.434204Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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