Transcriptional program biosensors for human cell type and state diagnosis - Pondeca, Benilde Francisco (2021)
RESUMO: A capacidade de manipular geneticamente um único tipo de célula numa mistura complexa de células, tal como no corpo humano, tem um enorme potencial terapêutico e de diagnóstico. Contudo, actualmente, a geração sistemática de dispositivos para a entrega de mensagens geneticamente codificadas a tipos celulares específicos dentro de organismos complexos não é possível. Uma das razões para esta limitação é a escassez de elementos reguladores específicos para tipos celulares e com capacidade de condução de genes, como por exemplo, “enhancers”. Testes empíricos utilizando um atlas de actividade de elementos reguladores humanos demonstraram que a maioria das células não possuem “enhancers” específicos. Estes mesmos testes mostram que as abordagens de genética interseccional através do uso de uma combinação de elementos reguladores podem aumentar a suscetibilidade das células de serem alvo de terapias genéticas personalizadas. Isto levou ao conceito “Versatile Entry Codes” (ou VEnCodes), que são as mais pequenas intersecções de elementos reguladores co-ativados que conferem valor de diagnóstico para distinguir entre a célula alvo e outros tipos de células não alvo dentro de uma mistura complexa de células. A aplicação prática dos VEnCodes requer a implementação de métodos de genética interseccional, tais como a montagem de proteínas fragmentadas ou a ativação de genes mediados por recombinases. Em geral, estes circuitos genéticos traduzem as múltiplas entradas da actividade dos “enhancers” num único resultado genético. Neste trabalho, tentamos gerar um biosensor genético para células humanas estaminais induzidas pluripotentes (hiPSCs), desenvolvendo uma estratégia de proteína fragmentada como método interseccional e acoplando-a aos VEnCodes para hiPSCs obtidos através de diferentes métodos. Primeiro, gerámos uma versão funcional do ativador transcricional dependente da tetraciclina inversa (rtTAv), utilizando uma combinação de três inteínas ortogonais, NpuDnaE, gp41-1, e NrdJ-1. Validámos então, em duas linhas hiPSC (IMR90-4 e Nelson), a actividade dos “enhancers” para células estaminais pluripotentes (OCT4, SOX2 e Nanog), assim como um “enhancer” por nós identificado através da exploração de dados de epigenómica publicamente acessíveis, o “enhancer” putativo de células estaminais localizado no cromossoma 2 (pSCE2). Validamos também as intersecções destes “enhancers” utilizando as versões do rtTAv divididas em 2x- e 3x. Estas intersecções foram então validadas como especificas para hiPSCs testando-as na linha não-iPSC, HeLa. Utilizámos também algoritmos xiv desenvolvidos no nosso laboratório para gerar VEnCodes para hiPSCs, baseados num subconjunto de dados de sequenciamento “Cap Analysis Gene Expression” (CAGE-seq) disponíveis publicamente (consórcio FANTOM5). Identificámos e validámos 12 “enhancers” para hiPSCs, que podem ser utilizados em estratégias baseadas em VEnCodes. Esperamos que a técnica VEnCode seja útil para superar as limitações impostas pelas atuais terapias genéticas e técnicas de modificação genética, permitindo um aumento na especificidade e sensibilidade na entrega de terapias genéticas.