Funcionalização de criogéis para purificação cromatográfica de DNA plasmídico - Brito, Andreia Sofia Costa (2015)
A cromatografia é uma poderosa ferramenta preparativa e analítica e um dos métodos de purificação mais importantes aplicados em processos “downstream” no ramo da Biotecnologia. A cromatografia de afinidade é uma das técnicas de eleição na purificação de DNA plasmídico (pDNA), sendo o ligando usado um dos fatores principais para o sucesso do processo. A purificação cromatográfica de pDNA requer suportes altamente porosos devido ao seu alto peso molecular e à elevada viscosidade das suas soluções. Os criogéis são materiais poliméricos macroporosos com canais interconectados, sendo uma alternativa aos suportes particulados convencionais na purificação de pDNA. O 3,8-diamino-6-fenilfenantridina (DAPP) e o tosilato de 5-pent-4-en-1-il-fenantridínio são ligandos de origem sintética e apresentam na sua estrutura um braço espaçador e carga positiva, o que os torna potencialmente adequados para a imobilização num criogel usando e o metacrilado de 2-hidroxietilo (HEMA) como co-monómero, para posteriores estudos cromatográficos. Neste projeto, foram testados dois métodos de imobilização do ligando à matriz e dois suportes de controlo. Foram efetuados vários ensaios cromatográficos, de retenção e de separação das isoformas superenrolada (sc) e circular aberta (oc) de pDNA. Adicionalmente, testou-se a separação da isoforma sc a partir de uma amostra de lisado clarificado. Os resultados mostram que o DAPP (5 mg/mL) e o HEMA são os ligandos com melhores perfis de retenção sendo por isso escolhidos para os estudos de separação de isoformas. Tanto o DAPP como o HEMA mostraram seletividade para a isoforma sc usando como passo de ligação uma solução tampão de acetato de sódio 10 mM pH 5,0 e como passo de eluição, tampão acetato de sódio 10 mM pH 5,0 na presença de NaCl. Quanto à amostra de lisado clarificado, apenas o HEMA revelou capacidade de separação da isoforma sc dos contaminantes RNA e proteínas. Estes estudos iniciais permitiram demonstrar o potencial da aplicabilidade de criogéis com ligandos sintéticos para a separação e purificação de pDNA por cromatografia de afinidade.