A novel lentivirus system to decode the non-coding DNA associated with Type-2 Diabetes risk

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Nogueira, João Miguel Carvalho
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/91702
Resumo: Dissertação de mestrado em Genética Molecular
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spelling A novel lentivirus system to decode the non-coding DNA associated with Type-2 Diabetes riskCromatinaDiabetes tipo 2 (T2D)LentivírusPotenciadoresChromatinEnhancersType-2 Diabetes (T2D)Ciências Naturais::Ciências BiológicasDissertação de mestrado em Genética MolecularDiabetes tipo 2 (T2D) é considerado uma pandemia dos tempos modernos e está associado a complicações graves, como doenças cardiovasculares e uma maior probabilidade de mortalidade prematura. A suscetibilidade genética a T2D está ligada a polimorfismos de nucleótido único (SNPs) em regiões de possíveis potenciadores, o que implica que alterações na regulação transcricional desempenham um papel no desenvolvimento da doença. Neste trabalho, o nosso objetivo é: 1) desenvolver um ensaio repórter de potenciadores adequado para testes em larga escala, 2) validar possíveis potenciadores de células beta humanas potencialmente associados ao desenvolvimento de T2D e 3) decifrar funcionalmente o código nucleotídico dos potenciadores validados. Construímos um lentivírus compatível com a clonagem em larga escala de bibliotecas de potenciadores, contendo um promotor mínimo e EGFP como gene repórter, para avaliar a atividade dos potenciadores clonados. Utilizando um potenciador do pâncreas endócrino previamente validado, testámos vários promotores mínimos e diferentes arquiteturas do lentivírus. Clonámos este potenciador a montante do promotor mínimo, a abordagem mais simplificada para testar a atividade do potenciador, ou a jusante, uma configuração que potencialmente recapitula a interação endógena potenciador-promotor através do looping da cromatina. Isto permitiu-nos encontrar a melhor solução que gera a maior relação sinal-ruído, mantendo simultaneamente as condições endógenas relativas à funcionalidade do potenciador. Em seguida, utilizámos marcas bioquímicas associadas à atividade de potenciador e SNPs associados a T2D para definir uma lista de aproximadamente 300 sequências reguladoras candidatas (CRSs). Clonámos esta biblioteca de CRSs no lentivírus desenvolvido, infetámos células MIN6 e através de FACS-sorting, isolámos células portadoras de CRSs capazes de aumentar a expressão de GFP para análise por sequenciação de nova geração (NGS) e para estabelecer linhas repórteres contendo um único potenciador. Os resultados deste estudo são cruciais para descodificar os mecanismos subjacentes às sequências de nucleótidos dos potenciadores e o seu impacto na expressão genética e, em última análise, no desenvolvimento do T2D.Type-2 diabetes (T2D) is considered a modern-day pandemic associated with severe complications like cardiovascular diseases and an increased likelihood of premature mortality. T2D's genetic susceptibility is tied to single nucleotide polymorphisms (SNPs) that overlap with predicted enhancers, implying that changes in transcriptional regulation play a role in the disease's development. In this work, we aimed to: 1) develop an enhancer reporter assay suitable for large-scale enhancer testing, 2) validate predicted human beta-cell enhancers potentially associated with T2D development and 3) functionally decipher the nucleotide code of the validated enhancers. We have built a lentivirus compatible with the large-scale cloning of libraries of enhancers, containing a minimal promoter and EGFP as a reporter gene, to assess the activity of cloned enhancers. Using a previously validated endocrine pancreas enhancer, we tested several minimal promoters and different architectures of the lentivirus. We cloned this enhancer upstream of the minimal promoter, the most simplified approach to test enhancer activity, or downstream, a configuration that potentially recapitulates the endogenous enhancer promoter interaction by chromatin looping. This allowed us to find the best solution that generates the highest signal-to-noise ratio, while simultaneously maintaining endogenous conditions regarding enhancer functionality. Next, we have used biochemical marks associated with enhancer activity and T2D-associated SNPs to define a list of approximately 300 candidate regulatory sequences (CRSs). We cloned this library of CRSs in the developed lentivirus, infected MIN6 cells, and through FACS-sorting, we isolated cells carrying CRSs capable of increasing GFP expression for next-generation sequencing (NGS) analysis and to establish single enhancer reporter lines. The findings of this study are crucial to decoding the underlying mechanisms of enhancer nucleotide sequences and their impact on gene expression and ultimately T2D development.Ferreira, Fábio Júnio VeríssimoCosta, Maria Manuela RibeiroUniversidade do MinhoNogueira, João Miguel Carvalho2023-11-302023-11-30T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/91702eng203530055info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-01-11T01:21:07Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/91702Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-28T17:54:50.842250Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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