Complexo gama-secretase em Trypanosoma cruzi bases para o desenvolvimento de novos testes diagnósticos específicos e novos alvos quimioterapêuticos - Gruszkowski, Carolina Conceição Bottino (2012)
Os métodos de diagnóstico usados hoje para a Doença de Chagas, embora simples e de baixo custo, podem apresentar baixas sensibilidade e especificidade ou reações cruzadas com outros patógenos. Da mesma forma, os medicamentos usados no tratamento apresentam severos efeitos colaterais. Dentre os vários alvos metabólicos sugeridos, as proteases têm sido apontadas como moléculas candidatas devido às suas particularidades. Recentemente o nosso grupo identificou duas aspartil proteases em T. Cruzi: uma solúvel (Cruzipsina-II) e outra membranar (Cruzipsina-I); entretanto, suas funções biológicas permaneceram desconhecidas. Os nossos resultados demonstram, pela primeira vez, a existência de um complexo proteolítico membranar em T. Cruzi com propriedades similares ao complexo \03B3-secretase de outras células eucarióticas. Usando ferramentas de bioinformática localizamos em banco de dados as sequências primárias de 3 das 4 proteínas do complexo (presenilina, nicastrina e Aph-1). Esta informação foi importante para caracterizarmos através de síntese paralela de peptídeos os epitopos B lineares das 3 proteínas usando soros de pacientes. A presenilina apresentou 10 epitopos majoritários, a nicastrina, 5 e a Aph-1, 10. Alguns epitopos foram selecionados por vários critérios e anticorpos anti-peptídeos obtidos em coelhos. O soro anti-peptídeo PRE-2 de presenilina identificou por immunoblotting a banda de 48kDa na fração CZP-I como sendo presenilina, enquanto o soro anti-peptídeo NIC-1 de nicastrina apresentou também uma marcação na mesma posição A análise por microscopia confocal em epimastigotas localizou as proteínas predominantemente nas regiões anterior e mediana das células. Além disso, as marcações mostraram-se mais fortes em células permeabilizadas, sugerindo a co-localização de ambas as proteínas nas membranas internas da célula. Um teste de ELISA empregando 4 peptídeos sintéticos da presenilina e nicastrina de T. Cruzi apresentou sensibilidade e especificidade de 71,59% e 70,53%, respectivamente. Utilizando a extração diferencial com detergente e análise por EGPA-SDS após cromatografia de afinidade, confirmamos na cepa CL Brener de T. Cruzi o perfil de bandas presentes na cepa Y, de 240, 56, 48 e 34 kDa na fração CZP-I (detergente) e 56, 52, 37 e 34 kDa na fração CZP-II (solúvel). Ensaios enzimáticos usando o inibidor L-685,458 e moduladores alostéricos DAPT e Composto XXI/E da presenilina humana sugeriram que aparentemente o sítio catalítico da presenilina de T. Cruzi possui uma constituição semelhante ao da presenilina humana, enquanto diferenças significativas puderam ser observadas no sítio alostérico. O inibidor de sítio ativo L-685,458 foi capaz de inibir 100% da atividade enzimática em 5\03BCM, enquanto os moduladores DAPT e Composto XXI/E não apresentaram uma inibição significativa. Portanto, os nossos estudos sugerem que devido as suas funções enzimáticas e localização celular a presenilina do T. Cruzi é um bom alvo quimioterapêutico e imunológico