Caracterização funcional dos genes envolvidos na síntese de UDP-Xilose a partir de UDP-Glicose em Trypanosoma cruzi - Lessa, Vinícius Lopes (2019)
Glicoconjugados são fundamentais para a sobrevivência e infectividade de tripanossomatídeos, atuando desde a proteção contra proteases no inseto vetor aos processos de invasão do hospedeiro mamífero e modulação do seu sistema imunológico. A síntese de glicoconjugados ocorre no Retículo Endoplasmático e no Complexo de Golgi pela adição de monossacarídeos a proteínas e lipideos. Nas reações de glicosilação, nucleotideos-açúcares atuam como os doadores ativados de açúcares. Dentre os tripanossamatídeos mais estudados, devido a sua importância médica (T. brucei, T. cruzi e Leishmania spp.), apenas T. cruzi apresenta os genes necessários para a síntese de UDP- xilose (UDP-Xil) e, de forma correspondente, é o único que apesenta resíduos de xilose em seus glicoconjugados. A síntese de UDP-Xil é feita em duas etapas: primeiramente, UDP-glicose é oxidada pela enzima UDP-glicose desidrogenase (UGD) a UDP-ácido glucurônico (UDP-GlcA); na segunda etapa, ocorre a descarboxilação de UDP-GlcA a UDP-Xil, pela enzima UDP-ácido glucurônico descarboxilase (UXS). Este trabalho tem como objetivo a caracterização funcional dos genes TcUGD e TcUXS de T. cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas. Primeiramente a análise in sílico mostrou que os genes TcUGD e TcUXS possuem apenas uma cópia no genoma do parasita, tornando viável a técnica de nocaute por recombinação homóloga. O nocaute do gene TcUGD foi feito pela substituição dos dois alelos pelos genes de resistência a neomicina e higromicina, sendo a correta inserção dos cassestes confirmada por PCR. Com relação ao gene TcUXS, tentativas para a sua deleção até o momento, não foram bem sucedidas. Após obter o nocaute do gene TcUGD foram feitos ensaios de curva de crescimento, microscopia eletrônica e de fluorescência, localização subcelular, diferenciação e análises em western blot. A curva de crescimento mostrou que a taxa de proliferação das formas epimastigotas do mutante tcugd\0394 é menor em comparação com o parasita selvagem. Por western blot e imunofluorescência, observamos que a glicosilação da proteína GP72 está alterada. De acordo com dados da literatura, em mutantes nulos de gp72, o flagelo se encontra desaderido do corpo do parasita. Apesar disso, experimentos de microscopia eletrônica de varredura e transmissão não mostraram alterações morfológicas aparentes no flagelo dos mutantes de tcugd\0394, o que sugere que a glicosilação de GP72 não é necessária para a sua atividade na adesão flagelar. A localização celular de TcUGD e TcUXS foi investigada pela fusão das proteínas com a etiqueta HA. Os resultados indicam uma possível localização da proteína TcUGD-HA no glicossomo, onde se supõe que ocorra a síntese de nucleotídeos-açúcares em tripanossomatídeos. O papel da xilose na infectividade e diferenciação do parasita ainda tem que ser avaliado, mas os resultados apresentados indicam que, apesar de um açúcar pouco abundante nos glicoconjugados de T. cruzi, níveis adequados de xilose são necessários para crescimento ótimo do parasita em cultura. Além disso, nossos dados indicam uma relação complexa entre a glicosilação de GP72 e sua atividade, que merece um estudo mais detalhado.