O papel da histona desacetilase 4 (TgHDAC4) na regulação da Expressão Gênica de Toxoplasma gondii - Fragoso, Mariana Sayuri Ishikawa (2017)
Toxoplasma gondii é um parasita intracelular obrigatório membro do filo Apicomplexa e responsável pela toxoplasmose, doença que afeta um quarto da população mundial e para a qual não há cura até o momento. Para sobreviver às barreiras do sistema imune, T. gondii se diferencia em diferentes estágios, sendo este processo, regulado pelo controle da expressão gênica. A regulação epigenética parece ter um papel fundamental neste parasita e dentre as enzimas que atuam nessa via, estão as histonas desacetilases (HDACs). O T. gondii possui sete histonas desacetilases (HDACs e Sir2), que são agrupadas em quatro classes de acordo com seus domínios, seus cofatores e sua sequência. O objetivo da presente dissertação foi realizar a caracterização da TgHDAC4, uma desacetilase classe IV, cujo único membro caracterizado é a histona desacetilase 11 (HDAC11) encontrada apenas em metazoários. TgHDAC4 possui dois sinais preditos: um de exportação nuclear e um de clivagem, cujas funções não estão caracterizadas. A busca por sequências similares, mostram que TgHDAC4 é uma proteína conservada exclusivamente em parasitas apicomplexas, cuja única região comum com outras espécies é a região do domínio HDAC característico. Para o estudo dessa enzima, focamos na construção de ferramentas de genética reversa, como o etiquetamento da proteína endógena e o nocaute de TgHDAC4. As construções destas ferramentas foram dificultadas devido a um erro de anotação na região C-terminal do gene no banco de dados de Toxoplasma, onde encontra-se um domínio HDAC incompleto, resultando em massa molecular predita de 98 kDa. A partir do sequenciamento da porção final do gene, foi possível encontrar o códon de terminação em fase, resultando em dois éxons a mais do que o predito, o que resultaria em uma proteína de 124 kDa. Uma vez corrigido, realizamos o etiquetamento na porção C-terminal da proteína endógena, adicionando uma etiqueta de HA e a partir de ensaios de imunofluorescência indireta e co-localização, foi possível verificar que TgHDAC4 está localizada no apicoplasto, co-localizando com a proteína FDR (Ferrodoxina-NADP+ reductase). Ensaios de western blot identificaram uma proteína de cerca de 100 kDa, um pouco menor do que o esperado. Também foram feitas diversas tentativas de nocaute por PCR de fusão, porém, apesar de ocorrer uma seleção dos transfectantes a partir do uso de drogas, nunca foram obtidos parasitas nocaute para TgHDAC4. Foi utilizado também, o sistema CRISPR-Cas9, gentilmente cedido pelo Dr. Hakimi (University Grenoble Alpes-França). Os plasmídeos foram transfectados e ensaios de imunofluorescência mostraram o parasita com uma morfologia alterada, especialmente no núcleo, porém, não foi possível a obtenção de parasita com mutações no gene que codifica TgHDAC4. Nossos dados indicam pela primeira vez a presença de uma desacetilase de histona no apicoplasto de Toxoplasma, cuja sequência é única a parasitas Apicomplexa. O apicoplasto é uma organela de origem endossimbiótica secundária, sendo considerado o calcanhar de Aquiles do parasita, por se tratar de organela essencial para sua sobrevivência. Entender como essa proteína atua, poderá fornecer novos dados não somente quanto a biologia dessa organela, mas futuramente identificar potenciais alvos para o tratamento efetivo da toxoplasmose.