Produção, imobilização por Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAS) e aplicação de lacases fúngicas na biodegradação de ciprofloxacino - Braga, Dayane Moreira (2021)
A ocorrência e os impactos adversos à saúde e ao meio ambiente causados pelos contaminantes emergentes (CE) têm despertado considerável preocupação nos últimos anos. Especialmente para os antibióticos, a presença generalizada em compartimentos ambientais, em decorrência do descarte inadequado ou da alta porcentagem de excreção após a administração, pode desencadear o desenvolvimento e a disseminação da resistência bacteriana, um problema grave de saúde pública. Até o momento, várias abordagens foram investigadas para a remoção dos fármacos presentes em efluentes através de estratégias de tratamentos alternativos aos convencionais. Nesse contexto, a biodegradação enzimática, principalmente com o uso de lacases (EC 1.10.3.2), recebeu considerável atenção. Para melhorar a estabilidade enzimática e possibilitar o reuso das lacases em ciclos biocatalíticos, diferentes técnicas de imobilização são empregadas, incluindo a metodologia Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs). Neste trabalho, lacases foram produzidas em duas condições utilizando fungos da podridão branca: (i) por monocultivo do Trametes villosa e (ii) pelo cultivo em pares do T. villosa com Pycnoporus sp., reportado pela primeira vez na literatura. O extrato bruto de T. villosa e de Pycnoporus sp., expressaram como proteínas principais lacases com massas moleculares aparentes entre 55 e 45 kDa e ambas foram identificadas no co-cultivo. Os extratos brutos dos dois cultivos foram imobilizados por CLEAs, utilizando sulfato de amônio 75% como precipitante e glutaraldeído como agente reticulador nas concentrações de 200 mM para lacases de T. villosa (Lac-TvL) e 162,5 mM para lacases do co-cultivo (Lac-CO). Após otimização as recuperações enzimáticas corresponderam a 27,77 ± 1,07% para CLEAs de T. villosa (CLEAs-TvL) e 35,38 ± 0,95% para CLEAs do co-cultivo (CLEAs-CO), após 3h de reação a 22 °C, de modo estático. As Lac-CO em sua forma livre demonstraram maior estabilidade térmica e ao pH do que as Lac-TvL. Lacases livres e imobilizadas apresentaram temperatura ótima para atividade catalítica entre 50 a 60 °C e pH ótimo ácido (entre 2,4 a 3,0). A imobilização dos extratos aumentou a termoestabilidade a 40 °C, retendo 100% da atividade residual após 180 min de reação, enquanto as formas livres Lac-TvL e LacCO mantiveram 82,08 ± 1,14% e 89,98 ± 1,90% de atividade, respectivamente. Em 55 °C, CLEAs-TvL mantiveram 79,37 ± 0,40%, valor 1,5 vezes maior do que foi obtido pela forma livre após 180 min; enquanto os CLEAs-CO apresentaram 88,59 ± 0,52% de atividade residual, 11% a mais do que Lac-CO livres. Lacases livres e CLEAs removeram com a mesma eficiência o fármaco ciprofloxacino (2,5 mg L-1), atingindo de 53 a 62% de biodegradação após 24h de reação (a 40 °C e 150 rpm) com o uso de ácido 4-hidroxibenzóico (HBA) como mediador, com redução da ação antimicrobiana sobre cepas de Escherichia coli.