Estudo de três metiltransferases da família SABATH e seus possíveis envolvimentos com uma via de biossíntese de jasmonatos específica do pistilo de Nicotiana tabacum - Avanci, Nilton César (2010)
O pistilo, contido na flor, contém diferentes tecidos especializados. O estudo da expressão gênica neste órgão é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Experimentos de RT-PCR, utilizando um \"pool\" de cDNAs de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, permitiram a clonagem do cDNA MT1. Este transcrito codifica uma proteína com alta similaridade a metiltransferases da família SABATH, e corresponde à seqüência completa do gene NtJAMT (Nicotiana tabacum Jasmonic Acid Methyltransferase). Metiltransferases são enzimas capazes de transferir radicais metil, a partir de um substrato doador (SAM - S-adenosil-L-metionina), para grupamentos carboxílicos livres em diversos metabólitos secundários de plantas, tais como os ácidos salicílico, benzóico, jasmônico e dihidro jasmônico. Os compostos metilados resultantes estão envolvidos em processos fisiológicos cruciais para as plantas, como por exemplo, desenvolvimento do vegetal, polinização, respostas de defesa, e sinalização química, entre outros. Através da abordagem de MEFS, ensaios de captação de compostos voláteis usando flores de Nicotiana tabacum no estádio 11 do desenvolvimento floral, foram realizados. Análises por CG-EM mostraram que apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa foram identificados, nos três períodos de amostragem (manhã , tarde e noite). Ensaios adicionais in vivo, utilizando pistilos inteiros macerados em solução saturada de CaCl2 5M, foram realizados. Após análises por MEFS/CG-EM, foi detectada a presença apenas do composto dihidroMeJa, e nenhum traço dos outros três compostos foi identificado. O cDNA MT1 foi clonado nos vetores pDEST17 e pETSUMO, resultando nas construções pEXP17-MT1 e pETSUMO-MT1 que produziram, respectivamente, as proteínas recombinantes rMT1 e rS-MT1. A proteína rMT1 foi utilizada em ensaios enzimáticos in vitro, na presença de diferentes substratos (ácidos salicílico/benzóico/jasmônico/dihidro jasmônico), em quantidades equimolares (10mM). Dois tipos de ensaios foram realizados: 1) os ácidos foram adicionados, separadamente, no meio de cultura bacteriano induzido, e também no lisado celular (ensaio individual); e 2) dois diferentes ácidos foram adicionados, em cada frasco, no meio de cultura bacteriano induzido (ensaio de competição). Análises por CG-EM mostraram que, nos ensaios individuais, a proteína rMT1 foi capaz de produzir o composto metiljasmonato (MeJa) predominantemente, tanto nos ensaios em meio de cultura, quanto nos ensaios utilizando o lisado celular, sendo que neste último obteve-se o melhor resultado. No ensaio em meio de cultura, o composto metilbenzoato (MeBa) foi obtido em baixa quantidade, o composto metilsalicilato (MeSa) foi produzido em uma quantidade extremamente baixa, e o composto dihidro metiljasmonato (dihidroMeJa) não foi detectado. Nos ensaios de competição enzimática, o composto MeJa foi o único a ser produzido, nos frascos onde o ácido jasmônico foi adicionado juntamente com outro ácido. A proteína rS-MT1, purificada em resina de níquel, foi capaz de produzir apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa, como demonstrado pelas análises por CG-EM. Ensaios enzimáticos in vitro, utilizando as proteínas r46B11 e r134B02, correspondendo aos putativos transcritos de processamento alternativo do gene NtJAMT, foram realizados. Utilizando os mesmos ácidos como substratos, nas mesmas concentrações daquelas usadas para rMT1, mostrouse que r46B11 produziu MeJa predominantemente, MeSa e MeBa em quantidades extremamente baixas, e o dihidroMeJa não foi produzido. De acordo com os resultados de CG-EM, a proteína r134B02 foi capaz de produzir apenas o MeJa. Anticorpos policlonais, produzidos contra a proteína rMT1 em camundongos Balb/C, foram utilizados em ensaios de ELISA e western blot. O anticorpo anti-rMT1 foi capaz de reconhecer as três proteínas, rMT1, r46B11 r134B02, em ensaios de western blot, demonstrando alta imunoreatividade. Ensaios adicionais de ELISA e western blot, com proteínas totais extraídas dos tecidos do estigma/estilete, ovário e folha, e o anticorpo antirMT1 como anticorpo primário, foram capazes de demonstrar a presença de metiltransferases nos tecidos do estigma/estilete e ovário, que estão ausentes em folhas. Esses resultados corroboram os experimentos de northern blot previamente realizados (Ângelo, 2001). A proteína r134B02 foi também utilizada para a produção de anticorpos policlonais em camundongos Balb/C. Em ensaios de western blot, esses anticorpos foram capazes de reconhecer a proteína r134B02, demonstrando alta imunoreatividade. Proteínas totais extraídas dos tecidos do estigma/estilete, ovário e folha foram usadas em um novo ensaio de western blot, com o anticorpo anti-r134B02. O resultado mostrou que esse anticorpo foi capaz de reconhecer uma banda correspondente à proteína MT1 nativa nos tecidos do estigma/estilete e ovário, assim como proteínas adicionais com massas variando de 18kDa a 32kDa nos mesmos tecidos, mas não reconheceu uma banda correspondente a proteína 134B02 nativa. Análises adicionais, realizadas em nosso banco de dados TOBEST, utilizando o programa TBlastX identificaram os clones TOBS114G06, TOBS040E09, TOBS076D02, codificando proteínas com alta similaridade às enzimas lipoxigenase (LOX), allene oxide cyclase (AOC) e 12-oxophytodienoate reductase (12-OPR), respectivamente, cruciais para a biossíntese do ácido jasmônico. Nenhum clone com similaridade significativa à enzima AOS foi encontrado durante esta análise. Além disso, uma pesquisa adicional no TOBEST identificou o clone TOBC130F10, codificando uma proteína com alta similaridade a fosfolipases do tipo A2, que são enzimas fundamentais nos primeiros passos da via de biossíntese do JA. Tomados juntos, os resultados apresentados aqui sugerem a existência de uma via de biossíntese do ácido jasmônico específica do pistilo, voltada para a produção de compostos jasmonatos nas flores de N. tabacum. É sugerido que tais compostos, atuando em sua forma volátil, estariam envolvidos em mecanismos de comunicação entre pistilos e estames da mesma flor, flores diferentes da mesma planta, ou em uma comunicação entre plantas vizinhas. Tal comunicação permitiria um controle temporal de amadurecimento dos órgãos reprodutivos (sincronização), favorecendo um processo de fertilização bem-sucedido