Vias alternativas mitocondriais: clonagem e caracterização bioquímica do gene NADH desidrogenase alternativa de \'A. fumigatus\' - Policarpo, Anna Carolina de Freitas (2008)
Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso e saprofítico encontrado em todas as regiões do mundo. A principal forma de infecção ocorre através da inalação de conídios do fungo com predominância de infecções no trato respiratório, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Foi caracterizada a função mitocondrial de A. fumigatus e sugeriu-se a presença de vias alternativas, dentre elas, a presença da NADH desidrogenase alternativa. A fim de colaborar com estudos para elucidação do papel desta enzima, foi realizada a clonagem dos genes das NADH desidrogenase alternativa interna e externa de A. fumigatus. A análise da seqüência de aminoácidos revelou um perfil de hidropaticidade com a presença de quatro regiões hidrofóbicas, semelhante às outras seqüências já descritas. Além disso, foram identificados dois motivos (GXGXXG) altamente conservados para ligações a nucleotídeos, dentro de um domínio os quais estão relacionados com a estrutura e atividade da enzima. A seqüência de cDNA do gene ndhiAf foi clonada em plasmídeo pYES2 e expressa em S. cerevisiae cepa CEN.PK873-2B; a expressão da NDHIAf foi verificada por técnica de Western-blot. A proteína foi expressa de forma ativa, conferindo à levedura uma respiração e a formação de um potencial de membrana resultantes da oxidação de substratos clássicos do complexo I, sugerindo sua localização na membrana mitocondrial interna. Além disso, as cepas expressando essa proteína foram capazes de crescer em meio contendo apenas lactato como fonte de carbono, uma característica atribuída à presença da NADH desidrogenase alternativa interna (NDHi). Considerando que a atividade das NDHIAf e NDHEAf estão sob controle metabólico, nos avaliamos o efeito de diferentes concentrações de glucose como única fonte de carbono no meio de cultura. Durante a germinação conidial, não foi observada expressão da NDHIAf e NDHEAf na presença de baixas concentrações de glucose. Entretanto, durante a fase de hifas foi observado um aumento na expressão de NDHIAf e NDHEAf. Por outro lado, em alta concentrações de glucose, durante a germinação conidial, foi observado expressão da NDHIAf mas nenhuma expressão da NDHEAf. Na fase de hifas observou-se um aumento da expressão da NDHIAf e uma diminuição da NDHEAf.