Genotipagem de linhagens de Yersinia spp. por high-resolution melting analysis - Souza, Roberto Antonio de (2013)
O gênero Yersinia pertence à família Enterobacteriaceae e compreende 17 espécies. Y. pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são reconhecidamente patógenos de humanos e animais. Y. pestis cause a peste. Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são agentes causadores, sobretudo, de gastroenterites transmitidas por água e alimentos. As demais 14 espécies são, usualmente, consideradas não-patogênicas, com exceção de Y. ruckeri sorogrupo O:1 que causa infecções em peixes. Nas últimas décadas, a tipagem molecular tornou-se uma importante ferramenta nos estudos filogenéticos de numerosos micro-organismos e o desenvolvimento de sistemas de tipagem rápidos e baratos pode facilitar os estudos epidemiológicos de infecções bacterianas. No presente estudo objetivou-se desenvolver um método de genotipagem de Yersinia spp. baseado em high-resolution melting analysis (HRMA) para diferenciar os single-nucleotide polymorphisms (SNPs) presentes nas sequências dos genes 16S rRNA, glnA, gyrB, hsp60 e recA e aplicá-lo na tipagem de 40 linhagens de Y. pseudotuberculosis e 50 linhagens de Y. enterocolitica, bem como separar por HRMA as espécies Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. Os SNPs foram determinados nas sequências dos loci acima citados a partir de um conjunto de 119 linhagens de Yersinia spp. depositadas no GenBank/EMBL/DDBJ. Foram encontrados nas sequências dos genes analisados de Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia, Y. mollaretii e Y. ruckeri 10, 10, 9, 6, 4, 1 e 1 SNPs, respectivamente. Nenhum SNP foi encontrado nas sequências analisadas de Y. pestis e um grande número de SNPs foi encontrado nas sequências analisadas de Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. massiliensis, o que impossibilitou a genotipagem dessas espécies por HRMA. As demais espécies não foram analisadas. Foram desenhados pares de primers para flanquear os SNPs encontrados em cada espécie de Yersinia testada. Usando um conjunto de primers espécie-específicos, a diversidade genética de cada espécie de Yersinia foi determinada por HRMA e a análise filogenética foi baseada na sequência concatenada composta pelos nucleotídeos identificados em cada fragmento analisado. O agrupamento foi realizado com o software BioNumerics usando o método UPGMA com 1.000 replicatas de bootstrap. A árvore filogenética ii construída para Y. pseudotuberculosis agrupou as linhagens em clusters bio-sorogrupo específicos. As linhagens do bio-sorogrupo 1/O:1 foram agrupadas em um cluster e as linhagens do bio-sorogrupo 2/O:3 em outro. A árvore filogenética construída para Y. enterocolitica agrupou as linhagens em três grupos. As linhagens altamente patogênicas, do biotipo 1B, foram agrupadas em um cluster, as linhagens de média patogenicidade, dos biotipos 2, 3, 4 e 5, foram agrupadas em um segundo cluster e as linhagens consideradas nãopatogênicas, do biotipo 1A, foram agrupadas em um terceiro cluster. O agrupamento encontrado em Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica foi consistente com o perfil patogênico característico dessas duas espécies. Nenhuma correlação epidemiológica significativa foi encontrada no agrupamento de Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia, Y. mollaretii e Y. ruckeri de acordo com os resultados de HRMA. Ademais, o método de HRMA aqui desenvolvido foi capaz de separar as espécies Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. O método de HRMA desenvolvido nesse estudo pode ser usado como uma alternativa para a genotipagem e para a diferenciação de Y. pseudotuberculosis de Y. enterocolitica. Esse método também pode complementar os métodos baseados em sequências e facilitar os estudos epidemiológicos dessas duas espécies de Yersinia.