Expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em culturas tridimensionais na presença de partículas de vidro bioativo - Alves, Luciana Bastos (2012)
O objetivo deste estudo foi analisar a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em culturas tridimensionais na presença ou não de partículas de vidro bioativo. Fibroblastos derivados do ligamento periodontal humano (hPDLF) e células osteogênicas da calvária de rato recém-nascidos foram plaqueadas em superfícies bidimensionais - lamínulas de plástico ThermanoxTM (controle); superfícies colágenas bidimensionais - ThermanoxTM revestidas por colágeno I sem partículas de vidro bioativo (2D) e com partículas de vidro bioativo (2D+VB); e em gel colágeno tridimensional sem vidro bioativo (3D) e com partículas (3D+VB). Foram avaliados: Viabilidade celular (MTT) nos tempos 3, 7 e 10 dias; Atividade de fosfatase alcalina (ALP) normalizada pelo conteúdo de proteína total em 7 e 14 dias; Immunolocalização de proteínas da matriz não-colágena (ALP e OPN em células hPDLF aos 7 e 14 dias e OPN e BSP em células osteogênicas aos 7 dias) por imunofluorescência indireta; Expressão quantitativa (PCR em tempo real) dos genes Periostina (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) e Fibromodulina (FBM), marcadores do fenótipo fibroblástico, em células hPDLF e Fosfatase Alcalina (ALP), Osteopontina (OPN), Sialoproteína Óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Colágeno I (COL I) e Runx2, marcadores osteoblásticos, em ambos os tipos celulares; e Mineralização (coloração por vermelho de Alizarina). Os resultados obtidos nas culturas de hPDLF mostraram que aos 3 dias a viabilidade celular em 2D+VB foi maior que no controle (p<0,05) e nenhuma diferença significante entre os grupos foi observada aos 7 e 10 dias. O conteúdo de proteína total aos 7 e 14 dias foi maior nas culturas 3D e 3D+VB, sendo aos 7 dias significantemente diferente de 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05) e aos 14 dias observou-se diferença significativa entre 3D e 2D. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior nos grupos 2D e 2D+VB comparados com 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05); e em 3D+VB menor que no controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias 3D e 3D+VB apresentaram maior atividade de ALP que o controle (p<0,05). Imunomarcações para OPN e ALP foram observadas nas células em 3D em ambos os períodos avaliados, e em 2D, 2D+VB, e controle apenas aos 14 dias. A expressão de RNAm para PRT aos 7 dias apresentou um perfil upregulated em 3D e 3D+VB comparados ao controle (p<0,05); para FBM a expressão gênica foi maior em 3D e 2D que em 3D+VB (p<0,05), e menor em 3D+VB comparado ao controle (p<0,05). As células em 2D exibiram maiores níveis de expressão de RNAm para S100A4 que as cultivadas em 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05). Os níveis de RNAm para COL I e ALP em 2D+VB e 3D, para RUNX2 e OPN em 3D e 2D, e para OC em 2D apresentaram-se upregulated em relação ao controle (p<0,05). Em 2D o nível de expressão de OC foi maior que em 2D+VB (p<0,05). Aos 14 dias houve uma diminuição da expressão de todos os genes analisados em relação às análises de 7 dias. Células em 3D+VB expressaram menores níveis de PRT que em 2D+VB (p<0,05). A expressão de RNAm para FBM foi maior em 2D e 2D+VB e para S100A4 maior em 2D comparado com 3D (p<0,05), nos quais os níveis de S100A4 ficaram downregulated com relação ao controle. COL I e ALP apresentaram-se downregulated em 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05) em relação ao controle. Entre 2D+VB e 3D+VB também foi observada diferença significativa para ALP. A expressão de RUNX2 foi maior em 3D que em 3D+VB (p<0,05) e de OC maior no controle. Nos grupos com VB foi observada maior formação de matriz calcificada aos 10 e 14 dias. Aos 10 dias não foram observadas áreas coradas por Alizarina através da microscopia, mas a quantidade de mineralização em 2D+VB e 3D+VB foi significativamente maior que no controle (p<0,05), 2D (p<0,05) e 3D (p<0,05). Aos 14 dias marcações mais extensas foram observadas nas culturas com VB, porém os nódulos mineralizados apresentavam-se independentes das partículas. 2D+VB e 3D+VB foram significativamente diferentes do controle (p<0,05) e 2D (p<0,05). As culturas de células osteogênicas mostraram que aos 7 dias as células crescidas sobre os arcabouços 3D+VB e 3D exibiram menores índices de viabilidade. Diferenças significativas foram observadas quando 3D+VB foi comparado aos grupos 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05); e entre 2D e 3D (p<0,05). Aos 3 e 10 dias não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular entre os grupos. O conteúdo de proteína total foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05) e no controle (p<0,05) aos 7 e 14 dias. Diferenças significantes também foram observadas entre 3D e 2D (p<0,05) aos 14 dias. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior em 2D+VB e 3D+VB. Diferenças significantes foram encontradas entre 2D e 2D+VB (p<0,05), 3D e 3D+VB (p<0,05) e entre 3D e controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias, 3D e 3D+VB apresentaram os menores valores de atividade de ALP, sendo a significantemente diferentes de 2D (p<0,05) e 2D+VB (p<0,05). Imunomarcações para OPN e BSP foram observadas aos 7 dias em 2D, 2D+VB, 3D e controle. Aos 7 dias os níveis expressão do RNAm para ALP, COL I e RUNX2 foram maiores em 3D e 3D+VB. Os genes OPN, OC e BSP exibiram níveis de expressão mais altos em 2D+VB. A expressão de COL I foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05). As células em 2D+VB apresentaram maiores níveis de expressão de OPN e OC que em 2D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05), nos quais a expressão desses genes e de BSP estavam downregulated em relação ao grupo controle. Aos 10 e 14 dias áreas coradas por vermelho de Alizarina foram observadas em todos os grupos, sendo mais extensas nos grupos que continham VB. Aos 10 dias a quantidade de cálcio em 3D+VB foi maior que no controle (p<0,05); e maior em 2D+VB comparado com 2D (p<0,05) e controle (p<0,05). Aos 14 dias 2D+VB e 3D+VB apresentaram uma quantidade de cálcio significativamente maior que no controle (p<0,05) e em 2D (p<0,05). Em conclusão, este estudo demonstrou que os arcabouços tridimensionais colágenos são capazes de suportar a viabilidade, proliferação e diferenciação celular se in vitro de hPDLF e células osteogênicas derivadas de calvária de rato recém-nascidos e de favorecerem a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em hPDLF. As partículas de VB em ambos os tipos celulares também contribuiram para viabilidade, diferenciação, formação de matriz mineralizada e expressão fenotípica.