Geração de organoides vascularizados como veículos produtores do fator VIII da coagulação em um modelo murino de hemofilia A - Souza, Lucas Eduardo Botelho de (2016)
A hemofilia A (HA) é uma doença hemorrágica causada por mutações que levam à deficiência na produção ou função do fator VIII da coagulação (FVIII). O desafio atual é estabelecer uma terapia profilática e duradoura capaz de assegurar níveis plasmáticos de FVIII suficientes para corrigir o fenótipo da HA. Uma das estratégias é modificar células ex vivo para expressar o FVIII e transplantá-las para que secretem a referida proteína in vivo. No entanto, esta abordagem tem sido limitada pela sobrevida curta das células transplantadas. Neste trabalho, hipotetizamos que células endoteliais vasculares da veia do cordão umbilical (HUVECs) e células progenitoras perivasculares como as células estromais do tecido adiposo (ADSCs) poderiam ser co-transplantadas para formar organoides vascularizados que serviriam como veículos produtores de FVIII in vivo. Para isso, primeiramente investigamos o potencial do meio para crescimento de células endoteliais (EGM-2) contendo fatores de crescimento pró-angiogênicos na manutenção das propriedades progenitoras e pró-angiogênicas das ADSCs após cultivo. Para tanto, primeiramente comparamos o efeito de formulações de meios convencionais (DMEM + 10% de soro fetal bovino [DMEM] e αMEM + 15% de SFB [αMEM]) e do EGM-2 na eficiência clonogênica, proliferação e diferenciação in vitro das ADSCs. ADSCs cultivadas em EGM-2 (ADSC-EGM) apresentaram a maior eficiência clonogênica, maior potencial proliferativo e maior capacidade de diferenciação adipogênica e osteogênica, seguidas pelas ADSC-αMEM e pelas ADSC-DMEM, respectivamente. Em seguida, investigamos o potencial das ADSC-EGM e ADSC-αMEM em dar suporte à sobrevida das HUVECs e de estimular a angiogênese. Para isso, modificamos HUVECs para expressar a proteína repórter bioluminescente luciferase 2 e utilizamos o sinal bioluminescente para monitorar a sobrevida das mesmas. Após co-cultivo em meio reduzido de fatores de crescimento, apenas as ADSC-EGM atenuaram a apoptose das HUVECluc, sendo que a sobrevida das HUVECluc foi diretamente proporcional à quantidade de ADSC-EGM nos co-cultivos. Além disso, apenas as ADSC-EGM estimularam a formação de cordões endoteliais pelas HUVECluc durante o co-cultivo sob privação de fatores de crescimento. Notadamente, a extensão e ramificação da rede de cordões endoteliais formada foi diretamente proporcional à quantidade de ADSC-EGM. Estes efeitos anti-apoptótico e pró-angiogênico das ADSC-EGM foram recapitulados quando utilizamos apenas o meio condicionado das ADSC-EGM, indicando que o secretoma das ADSCs é alterado após cultivo em EGM-2. Em seguida, ADSCs e HUVECluc foram co-transplantadas subcutaneamente em camundongos imunodeficientes e a sobrevida das HUVECluc foi avaliada pela quantificação da bioluminescência. Após 60 dias, a quantidade de HUVECluc vivas foi equivalente entre aquelas transplantadas sozinhas ou com ADSC-αMEM (15,0%±0,7% vs 13,0%±0,5%, respectivamente). Entretanto, a sobrevida das HUVECluc co-transplantadas com ADSCEGM atingiu 105%±3,5%. Análises histológicas demonstraram que os organoides gerados pela co-infusão de HUVECluc e ADSC-EGM apresentaram maior densidade vascular e os vasos sanguíneos eram funcionais, a julgar pela presença de eritrócitos em seus lúmens. Em seguida, as ADSC-EGM e HUVECs foram modificadas para expressar o FVIII humano com o domínio B parcialmente deletado e transplantadas subcutaneamente em camundongos hemofílicos A imunodeficientes, os quais foram gerados após o cruzamento de machos NSG com fêmeas hemofílicas. Em todas as tentativas de transplante não houve aumento na atividade biológica do FVIII no plasma dos animais. Para avaliar se a rota de infusão estava influenciando a distribuição do FVIII na circulação, transplantamos células de adenocarcinoma hepático SK-HEP expressando FVIII e luciferase pelas vias subcutânea e intra-hepática. Após 8 dias, apenas os animais que receberam o transplante intra-hepático apresentaram uma atividade biológica do FVIII no plasma superior a 0,5 UI/mL. Após 15 dias, a atividade detectada foi pelo menos de 1 UI/mL, ao passo que os animais transplantados subcutaneamente não apresentavam níveis detectáveis de FVIII no plasma. Utilizando dados de bioluminescência, observamos que as células transplantadas subcutaneamente ou no fígado apresentavam a mesma velocidade de crescimento. Em suma, nosso dados demonstram que o cultivo das ADSCs em um microambiente pró-angiogênico aumenta sua eficiência clonogênica, sua capacidade de diferenciação in vitro e seu potencial em promover a sobrevida de células endoteliais e estimular a angiogênese in vivo em comparação com estratégias de cultivo convencionais. Estas observações abrem caminho para a identificação de moléculas importantes na regulação da multipotência e da atividade pró-angiogênica das ADSCs. Além disso, nossos achados estabelecem uma estratégia capaz de aumentar a eficiência terapêutica das ADSCs contra doenças isquêmicas e de elevar a sobrevida de células endoteliais co-transplantadas para servir como veículo produtor de proteínas terapêuticas in vivo. Por fim, concluímos que o local de implante das células expressando FVIII é crítico para a eficiência terapêutica deste tipo de terapia celular para a correção da HA.