Purificação e caracterização bioquímica da β-xilosidase intracelular de Humicola grisea var. thermoidea - Almeida, Elzira Maria de (1994)
Neste trabalho foram investigadas ceracterísticas bioquímicas da β-xilosidase intracelular purificada do fungo filamentoso termófilo Humicola grisea var. thermoidea. O fungo foi cultivado sob agitação à 40 ºC, por 24 horas, usando xilano como fonte de carbono e a enzima foi purificada através de choque térmico do extrato bruto de células (50 ºC/20 min), precipitação com sulfato de amônio (50-75%) e cromatografia em coluna de DEAE-celulose e Sephadex G-100. A enzima apresentou uma forte adsorção à resina de DEAE-celulose e foi eluída sem aumento da força iônica do tampão. Após este procedimento e concentração de enzima com TCA 10%, obteve-se uma única banda protéica com atividade de β-xilosidase em PAGE 8% e SDS-PAGE 7%. O peso molecular da enzima purificada foi estimado em 48.000 Da por cromatografia de exclusão molecular e 39.500 Da por SDS-PAGE. A diferença entre os pesos moleculares obtidos em condições desnaturantes e não desnaturantes, sugeriu que a enzima contém moléculas de gordura em sua estrutura. A enzima não apresentou carboidratos na molécula. O pH e temperatura ótimos de atividade da enzima purificada foi de 6,0 e 50 °C, respectivamente. A enzima exibiu alta especificidade pelos substratos p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo e xilobiose. A presença de xilose (10mM) no meio de reação não inibiu a atividade enzimática. A enzima purificada foi ativada por Ca2+, Mg2+ e Fe3+ e fortemente inibida por Cu2+, Hg2+ e Zn2+. Estudos de termoestabilidade mostraram que a enzima é estável à temperatura de 50 ºC apenes na presença de substrato. A constante de Michaelis-Menten (Km) foi de 0,49 mM e a Vmáx de 2,56µmol de PNP/ min.mg proteína. As propriedades bioquímicas da β-xilosidase intrecelular purificada, quando o fungo é cultivado em xileno, foram comparadas com uma enzima secretada pelo fungo quando cultivado em bagaço-de-cana (PERALTA,1989). A enzima intracelular purificada apresentou similaridades com relação às propriedades bioquímicas da enzima extracelular (Km, peso molecular, temperatura e pH ótimos de atividade) com exceção ao conteúdo de carboidratos na molécula (35% na enzima extracelular). Estas similaridades sugeriram que a enzima intracelular pode sofrer uma glicosilação pós-traducional e posterior secreção. A enzima extracelular foi classificada como sendo uma glicosidase com atividade de xilosidase, ativa sobre materiais celulósicos e hemicelulósicos e a intracelular, uma β-xilosidase típica. Desta forma o Humicola pode ser um modelo para o estudo da glicosilação e exportação de proteínas em fungos filamentosos.