Correlação da expressão de microRNAs através da varredura por microarray e de seus alvos preditos com a carcinogênese e o prognóstico do carcinoma espinocelular peniano - Murta, Claudio Bovolenta (2022)
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: O câncer de pênis (CaPe) é uma doença rara com alta morbidade e mortalidade. A carcinogênese não é totalmente compreendida e, embora alguns biomarcadores relacionados a prognóstico tenham sido descritos, até o momento nenhum foi adotado na prática clínica. Nosso objetivo foi identificar, através de varredura por microarray, os miRNAs diferencialmente expressos (DEmiR) entre tecido tumoral (TT) versus não neoplásico (TNN) e pacientes com doença metastática versus localizada, bem como identificar os genes diferencialmente expressos (DEG) entre estes grupos e realizar análise integrativa miRNA-mRNA propondo assim elucidar a via de tumorigênese e a descoberta de novos biomarcadores para o CaPe. MÉTODOS: Foram coletadas prospectivamente amostras frescas de TT e TNN adjacente de 24 pacientes com carcinoma espinocelular (CEC) de pênis operados em nossa instituição entre julho de 2015 a janeiro de 2018. Inicialmente, foram selecionados 5 pacientes com doença localizada e 6 com doença metastática linfonodal para realização do microarray. O RNA foi purificado e a análise de varredura com o microarray utilizou o miRNA 4.0 Genechip (Affymetrix). Foram identificados os DEmiRs entre TT e TNN utilizando-se o programa TAC (Affymetrix) com fold change (FC)>2,0, p<0,01 e false discovery rate (FDR)<0,05. Foram também identificados os DEmiRs entre os grupos de doença metastática versus localizada com FC>1,5 e p<0,05. As expressões dos DEmiRs selecionados para validação independente (N=13) e em amostra expandida (N=24) nos grupos foram avaliadas através de qRT-PCR. Oitenta e três genes foram escolhidos para as comparações entre os grupos, baseados em suas relações com miRNAs encontrados no microarray pelo miRTarBase 8.0, descrição em CaPe e envolvidos em carcinogênese. A expressão dos genes escolhidos foi avaliada através da plataforma nanofluídica por qRT-PCR e comparadas entre os grupos de TT com TNN e com doença metastática e localizada. Foram correlacionados a expressão dos DEmiRs e os DEGs com os fatores clássicos de prognóstico no CaPe e a sobrevida câncer específica e global. Avaliação in silico foi realizada comparando-se os DEmiRs da comparação TT vs TNN com banco de dados ArrayExpress (E-MTAB-3087) previamente publicados em CaPe, bem como os DEGs no banco de dados Gene Expression Omnibus. RESULTADOS: A idade média dos 24 pacientes foi de 61,8 anos. O seguimento mediano foi de 39,8 meses. O tratamento local foi a penectomia parcial em 17 (70,8%) casos, o restante foi submetido à penectomia total. O estadiamento patológico foi pT1, pT2, pT3 em 4 (16,6%), 13 (54,2%) e 7 (29,2%) casos, respectivamente. Dezesseis (66,7%) pacientes foram submetidos a linfadenectomia inguinal. Destes, 11 (68,7%) tinham doença metastática pN+. Na análise de varredura por microarray entre TT versus TNN, encontramos 69 DEmiRs (41 sub e 28 superexpressos), dos quais 9 foram selecionados para validação baseado em maior FC, presença na lista dos tumores metastáticos versus localizados, publicação prévia em CaPe e CEC (miR-145-5p, miR432-5p, miR-487b-3p, miR-30a-5p, miR-149-5p, miR-200a-5p, miR-224-5p, miR-31-3p, miR-31-5p). Na validação independente somente o miR-149-5p não confirmou resultado do microarray. Cinco DEmiRs foram validados in silico no banco de dados E-MTAB3087 (miR-30a-5p, miR-432-5p, miR-487b-3p, miR-145-5p e miR-31-5p). Na comparação entre tumor metastático versus localizado, 21 DEmiRs (5 sub e 16 superexpressos) foram identificados. Foram selecionados 7 deste grupo para validação de acordo com maior FC e relevância biológica (miR-181c-5p, 744-5p, 196b-5p, 200a-5p, 152-3p, 421, 149-5p). Na validação independente através de qRT-PCR nenhum manteve significância estatística, entretanto na amostra expandida com todos os 24 casos, houve confirmação dos miR-744-5p (p=0,003) e miR-421 (p=0,005). Nas correlações entre DEmiRs e o prognóstico, observamos que a menor expressão do miR-31-3p estava correlacionado ao grupo de maior estádio T (p=0,043) e que a maior expressão do miR421 reduzia a sobrevida global (p=0,038). Avaliamos a expressão de 83 genes por qRTPCR e encontramos 37 DEGs entre TT e TNN. Seis deles com boa acurácia para distinguir os grupos com AUC>0,78 (IL1A, MCM2, MMP1, MMP12, SFN e VEGFA). Na análise integrativa, encontramos 8 pares de miRNA-mRNA que mudaram significativamente sua relação, sendo a maior alteração observada para o par miR-432- 5p-TP53. Entre os DEGs da comparação entre os pacientes metastáticos e localizados encontramos 7 DEGs (CCND1, EGFR, ENTPD5, HOXA10, IGF1R, MYC, SNAI2), todos com boa acurácia (AUC>0,74) na distinção entre os grupos. Observamos correlações significativas entre maior expressão do MMP1 com tamanho tumoral (p=0,042), grau (p=0,045), estádio T patológico (p=0,018) e invasão perineural (p=0,007). O gene MMP1 é regulado pelo miR-145-5p que está subexpresso na amostra tumoral. Observamos também correlação entre maior expressão do CCND1 (p=0,006) e EGFR (p=0,001) com grau tumoral; e menor expressão de MMP9 com invasão microvascular (p=0,044). Nas curvas de sobrevida, a maior expressão dos genes CCND1, EGFR, GADD45A, MYC, SNAI2 e SRC e menor dos CDH1, CDKN1A, KLF4 e TP63 estavam associados a mortalidade por CaPe. A maior expressão dos genes FGF2, GADD45A, IL6, MYC, NES e NRP1 e a subexpressão do CDH1 foram correlacionadas a menor sobrevida global. CONCLUSÕES: Descrevemos uma assinatura molecular relacionada à carcinogênese do pênis baseada nas expressões dos miR-432-5p, miR-478b-3p, miR-145-5p, miR-30a-5p, miR-200a-5p, miR-224-5p, miR-31-3p e miR-31-5p e dos genes IL1A, MCM2, MMP1, MMP12, SFN e VEGFA. Identificamos um painel de potenciais biomarcadores de prognóstico no CaPe baseada na expressão dos miR-421, miR-744-5p, miR31-3p e dos genes CCND1, CDH1, CDKN1A, EGFR, ENTPD5, FGF2, GADD45A, HOXA10, IGF1R, KLF4, MMP1, MYC, NES, NRP1, SNAI2, SRC e TP63