Vias de sinalização e de regulação das beta-lactamases de Chromobacterium violaceum - Alves, Luís Gustavo Laranjeiro (2024)
Um dos maiores problemas de saúde pública é o aumento da resistência a antibióticos em bactérias patogênicas. Em todo o mundo, há uma alta prevalência de resistência aos antibióticos beta-lactâmicos mediada por enzimas beta-lactamases. Por produzir duas beta-lactamases cromossômicas, AmpC e CphA, a bactéria oportunista ambiental Chromobacterium violaceum é intrinsecamente resistente a vários antibióticos beta-lactâmicos. No entanto, pouco se sabe sobre as vias de sinalização e regulação destas enzimas nesta bactéria. Neste estudo, isolamos mutantes espontâneos resistentes ao antibiótico ceftazidima para elucidar como essas beta-lactamases são reguladas. Por antibiograma, confirmamos a resistência a vários outros beta-lactâmicos em 13 destes mutantes espontâneos. Em 12 deles, ocorreu a hiperexpressão dos genes ampC e cphA, conforme verificado por ensaios de beta-galactosidase. O sequenciamento de DNA dos três genes parálogos da amidase AmpD de C. violaceum, uma enzima envolvida na reciclagem do peptideoglicano, revelou mutações de diferentes tipos em AmpD1 (CV_0566) na maioria dos mutantes espontâneos, mas não em AmpD2 ou AmpD3. Mutantes nulos simples e combinados dos genes das três amidases foram obtidos. A hiperexpressão de ambas as beta-lactamases e a aumentada resistência aos beta-lactâmicos foram verificadas apenas nos mutantes com deleção de ampD1. Quando introduzido nos mutantes nulos ou espontâneos de ampD1, o gene ampD1 reverteu os fenótipos destes mutantes. A amidase AmpD1 de C. violaceum possui arquitetura única entre as amidases bacterianas com presença de um domínio N-terminal de acetiltransferase. Três mutantes espontâneos foram escolhidos para sequenciamento completo do genoma (WGS). Os resultados revelaram mutações nos genes CV_1820 (RNAse E), CV_2060 (RseB, regulador negativo de sigma E) e CV_3538 (IspG, enzima de síntese de isoprenóides), sugerindo novas vias potencialmente envolvidas na resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. A mutação identificada por WGS na região intergênica do fator de transcrição CV_1922, na verdade, revelou-se um artefato decorrente da excisão do gene CV_1923, uma das cinco cópias de transposases encontradas em C. violaceum. Como alternativa, um ensaio de pull-down de afinidade ao DNA permitiu isolar diferentes proteínas que podem ser candidatos a reguladores transcricionais de ambas beta-lactamases. Em conclusão, nossos dados indicam que a ocorrência de mutações no gene da amidase AmpD1 é um mecanismo comum que leva a hiperexpressão das beta-lactamases AmpC e CphA e a alta resistência de C. violaceum a vários antibióticos beta-lactâmicos.