Identificação, isolamento e caracterização do inibidor de PLA2 presente no soro da serpente não peçonhenta Boa constrictor - Rodrigues, Caroline Fabri Bittencourt (2021)
O plasma de uma série de animais possui componentes que promovem uma resistência natural ao envenenamento, através da inibição de proteínas específicas que compõem o veneno das serpentes, como as fosfolipases A2 (PLA2s). A hipótese mais consistente para a presença de tais inibidores seria a proteção contra o auto envenenamento. Porém, a ocorrência de inibidores no plasma de serpentes não peçonhentas, bem como em outras espécies de animais, abriu novas perspectivas em relação à presença de tais moléculas. Deste modo, o presente trabalho tem como objetivo a identificação, o isolamento e a caracterização de um inibidor de PLA2 (PLI) presente no soro da Boa constrictor (BoaPLI), serpente não peçonhenta que habita extensamente o território brasileiro. Para tal, o inibidor foi isolado do soro de B. constrictor através de dois passos cromatográficos, tendo 0,63% de recuperação. A partir de então, foi realizada sua caracterização estrutural por SDS-PAGE, sendo identificada uma banda principal a 25 kDa, em condições redutoras, e 20 kDa, em condições não redutoras. Sua estrutura primária parcial foi identificada, possuindo alta homologia com outros PLIγs, como o de Lachesis muta. Sua estrutura secundária também é semelhante a outros PLIγs. Além disso, quando incubado com a Asp-49 e Lys-49 PLA2s, em análise por dicroísmo circular, observou-se que não houve alteração severa de seu espectro. As análises cromatográficas de exclusão molecular (SEC) corroboraram a hipótese de formação de oligômeros do inibidor isolado. Para investigar o tipo de interação entre o PLI e PLA2s, uma varredura de fluorescência foi realizada, mostrando uma diminuição no pico da fluorescência quando incubadas. A interação entre inibidor e PLA2 também foi evidenciada por western blotting. Uma vez a interação confirmada, foi realizado o ensaio de inibição enzimática com a Asp-49 PLA2, uma vez que a substituição no resíduo 49 (Lys-49 PLA2) leva a perda de atividade enzimática. O BoaγPLI apresentou inibição de caráter dose-dependente, chegando a ∼48% de inibição. Seu potencial inibitório também foi certificado por ensaios farmacológicos de edema e miotoxicidade. Não houve diferença entre o potencial inibitório com as duas isoformas de PLA2s testadas. Para averiguar o envolvimento do inibidor com tal atividade, foi realizado o ensaio de tromboelastometria, no qual o tempo de coagulação foi diminuído quando a crotoxina foi incubada com o inibidor. Ademais, para investigação do potencial inibitório do BoaγPLI em relação ao veneno total de uma serpente ofiófaga, foi testada a sua ação inibitória da atividade anticoagulante do veneno de Micrurus laticollaris. O BoaγPLI foi eficaz na inibição da atividade anticoagulante, evidenciado pelo retorno em tempo de coagulação e da força do coágulo comparado ao controle. Deste modo, o presente estudo pode contribuir introduzindo novas perspectivas para inibidores de PLA2 provenientes de plasma de serpentes não peçonhentas.