Expressão em E. coli, purificação e caracterização parcial do domínio ligante de calmodulina da miosina-V de cérebro de galinha - Alcântara, Luiz Carlos Júnior (1996)
Miosina-V é uma miosina ligante de calmodulina não convencional enriquecida em cérebro que está provavelmente envolvida no transporte de vesículas em neurônios e células gliais. Análise bioquímica e estrutural mostrou que esta miosina é composta por 3 grandes domínios: um domínio cabeça-motor, uma região pescoço e uma cauda com regiões em \"coiled-coil\" e globulares. O domínio pescoço, entre os resíduos 765 e 909, contém uma série de seis repetições imperfeitas de aproximadamente 23 aminoácidos que são ricas em resíduos hidrofóbicos e básicos e apresentam a sequência concenso IQXXXRGXXXRXXY, denominada \"motivo IQ\". Estas repetições são similares ao sítio ligante de calmodulina da neuromodulina e as repetições presentes na junção cabeça-cauda da miosina-I de borda em escova. Ambas as proteínas e miosina-V ligam calmodulina de maneira independente de Ca2+. O \"motivo-IQ\" também está presente em todas as outras miosinas conhecidas, na região correspondente aos sítios ligantes de cadeias leves. Recentemente, as estruturas tridimensionais da região ligante de cadeias leves da miosina-II de músculo esquelético de galinha e de molusco de concha foram resolvidas, demonstrando que o \"motivo-IQ\" é o sítio de ligação das cadeias leves essencial e regulatória. O presente trabalho resultou na expressão em E. coli do domínio pescoço em fusão com a proteína ligante de maltose e sua purificação através de cromatografia de afinidade, utilizando uma resina de CaM acoplada à sepharose 4B. Observou-se ligação da proteína de fusão à calmodulina na ausência e presença de Ca2+. Entretanto, uma ligação mais forte ocorreu na presença de Ca2+ e alta força iônica. A ligação com ou sem Ca2+ foi confirmada usando os ensaios de \"overlay\" com CaM-biotinilada como uma sonda e estreptavidina conjugada a fosfatase alcalina como sistema de detecção. Também o complexo formado entre o pescoço expresso e a calmodulina biotinilada em solução foi capturada por esferas magnéticas ligadas a estreptavidina na presença e ausência de Ca2+. Foi possível clivar a proteína de fusão, utilizando o fator Xa de coagulação bovino, liberando o domínio pescoço livre da PLM.