Identificação de proteínas expressas na região cambial de Eucalyptus grandis, por espectrometria de massa - Meireles, Karem Guimarães Xavier (2006)
O Brasil é um país de vocação florestal, mantendo atualmente grandes áreas reflorestadas com Eucalyptus, cuja madeira é utilizada como matéria-prima em diversas indústrias de base florestal. A projeção é de uma crescente demanda de madeira e, em função disso, é necessário associar novas estratégias aos programas de melhoramento genético, que resultem não somente no aumento da produtividade, como também na adequação de caracteres da qualidade da madeira para um produto final. A qualidade da madeira depende de diversas propriedades do xilema secundário, tecido que constitui a madeira. O desenvolvimento de tecnologias proteômicas, que permitem analisar os genes diretamente ao nível de seus produtos, pode contribuir para o maior entendimento dos processos relacionados à formação da madeira. O objetivo principal deste trabalho foi identificar as proteínas mais abundantemente expressas na região cambial, envolvidas na formação da madeira de Eucalyptus grandis, aos 6,3 anos de idade. A região cambial foi caracterizada por células do câmbio e por células diferenciadas em floema e xilema secundários. A amostragem foi realizada por meio da abertura de painéis nas árvores, seguido da raspagem de sua casca interna e da superfície do fuste. Foram testados dois métodos de extração de proteínas, que utilizam ácido tricloroacético e fenol, respectivamente, a fim de avaliar qual deles proporciona a obtenção de extratos protéicos concentrados e livres de contaminantes. Ensaios foram realizados para ajustar o tempo e o tampão de focalização isoelétrica das proteínas. Um extrato contendo cerca de 500 μg de proteínas foi utilizado para a preparação dos géis 2D de pH 4-7. Dois tipos de coloração de géis foram avaliados. Os spots foram recortados para proceder a digestão tríptica das proteínas. A solução contendo os peptídeos de uma amostra foi analisada por espectrometria de massa. As seqüências experimentais foram contrastadas com uma base de seqüências peptídicas e um banco de ESTs espécie-específico. As imagens dos géis bidimensionais foram analisadas, com a finalidade de fazer inferências sobre o nível de expressão de cada proteína identificada na região cambial, como também correlacioná-la com a expressão de seu transcrito correspondente. O método com fenol mostrou-se o mais eficiente para extrair proteínas da região cambial. Foi observado que as proteínas foram totalmente focalizadas a 74.000 Vh. A coloração com Coomassie Brilliant Blue G-250 permitiu a revelação de um número maior de spots e mostrou-se compatível com a espectrometria de massa. A análise LC/MS/MS das amostras permitiu a identificação de 69 spots, correspondendo a 41 proteínas distintas da região cambial, sendo 34,15% delas, representadas em múltiplos spots, As proteínas identificadas exercem seu papel biológico na produção de energia (22%), em processos celulares (19,5%), como componentes estruturais (17,1%), nos metabolismos de aminoácidos (14,6%) e macromolecular (19,5%), e no transporte de moléculas (2,4%). Oito spots mostraram similaridade de seqüências em ambas bases de dados, mas nenhuma função foi atribuída a eles. A análise da correlação revelou uma tendência para um grupo restrito de proteínas, de que os transcritos que se mostraram pouco abundantes corresponderam a proteínas altamente expressas na região cambial.