Caracterização da atividade β-glucosidásica de Humicola insolens - Souza, Flavio Henrique Moreira de (2009)
Os materiais lignocelulósicos são os principais resíduos da atividade agroindustrial. Atualmente, é grande a procura por enzimas capazes de degradá-los, visando à produção de diversos compostos químicos, em especial combustíveis renováveis, como o etanol, com baixo impacto ambiental. A celulose é o polissacarídeo majoritário da parede celular das plantas e a macromolécula mais abundante produzida na Terra. A degradação enzimática da celulose é, portanto, de especial significado ambiental e comercial. A celulose é um polissacarídeo linear composto de unidades de glicose ligadas por ligações glicosídicas do tipo -(1,4). A hidrólise enzimática da celulose envolve pelo menos três classes de enzimas: endoglucanases, celobiohidrolases (exoglucanases) e -glucosidases. Apenas as duas primeiras enzimas agem diretamente sobre a celulose, depolimerizando as cadeias e liberando oligossacarídeos de diferentes tamanhos e celobiose. A celobiose é a unidade básica repetitiva da celulose e pode ser convertida em resíduos de glicose pelas -glucosidases. Este sistema enzimático funciona sinergisticamente, e as -glucosidases são responsáveis pelo passo terminal da sacarificação da celulose, liberando as endoglucanases e exoglucanases da inibição por celobiose. Entretanto, em sua grande maioria, as -glucosidases também são inibidas pelo produto da reação catalisada, o que vem despertando um interesse crescente por enzimas tolerantes à glicose. Resultados preliminares mostraram que, quando cultivado em meio líquido empregando avicel como fonte de carbono, o fungo termófilo Humicola insolens é um bom produtor de -glucosidases. Além disso, a atividade do extrato bruto micelial foi estimulada por glicose ou xilose. A análise eletroforética deste extrato bruto, em condições não desnaturantes, revelou ainda a presença de duas bandas de atividade ß-glucosidásica, sendo uma estimulada e outra inibida por glicose em concentração 100 mM. Este trabalho descreve a produção, purificação e caracterização bioquímica de duas -glucosidases miceliais de Humicola insolens. As melhores condições de cultivo para a produção de -glucosidase micelial foram 40°C, 120 rpm, em meio constituído de K2HPO4 0,1%, MgSO4.7H2O 0,05%, solução de traços de elementos (25 L para cada 50 mL de meio), extrato de levedura 0,8% e avicel 0,75%, em pH inicial 6,0. O tempo de cultivo para máxima produção foi de 4 dias. As duas -glucosidases miceliais, denominadas BGH I e BGH II, foram purificadas por um procedimento que envolveu precipitação com sulfato de amônio a 75%, seguida por dessalificação em Sephadex G-25, cromatografia de troca iônica em DEAE fractogel e filtração em gel de Sephacryl S-200. Após a purificação, BGH I atingiu uma atividade específica de 25 U/mg com um rendimento de 7,9% e fator de purificação 27,5 vezes. Já a forma BGH II apresentou atividade específica de 15,2 U/mg, com rendimento de 30% e fator de purificação 16,5 vezes. As enzimas apresentaram um conteúdo de carboidratos totais de 51 % (BGH I) e 21% p/p (BGH II). A forma BGH I apresentou massa molecular aparente, estimada por filtração em gel, de 282 kDa, enquanto para (BGH II) este valor foi de 94 kDa. A análise em SDS-PAGE de BGH II mostrou uma única banda protéica de 55 kDa, sugerindo que a forma nativa da enzima é um homodimero. Já para BGH I foram reveladas 3 bandas, com massa moleculares aparentes de 31 kDa, 52 kDa e 132 kDa, sugerindo uma estrutura tetramérica. Entretanto, considerando que se trata de uma enzima altamente glicosilada, estes resultados devem ser interpretados com cautela. Estudos de espectrometria de massas de BGH II demonstraram boa similaridade da sua seqüência de aminoácidos com aquela de uma -glucosidase de Humicola grisea var. thermoidea, com cerca de 22% de recobrimento. A temperatura ótima de reação foi de 60ºC para ambas as -glucosidases purificadas e os valores de pH ótimo foram 5,0 e 6,0 para BGH I e BGH II, respectivamente. Ambas as enzimas foram estáveis quando incubadas em água até 1 hora, a 50ºC; BGH I apresentou um tempo de meia-vida de 47 min a 60°C, enquanto BGH II apresentou um tempo de meia-vida de 40 min a 55°C. Quando incubadas em tampões de diferentes pH por 24 h, BGH I mostrou-se estável em uma faixa de 5-8 e BGH II em pH 6-8. A forma BGH I apresentou maior especificidade de substrato que BGH II, hidrolisando apenas p-nitrofenil-ß-D-glucopiranosídeo, celobiose e salicina, dentre todos os substratos testados. Já BGH II hidrolisou celobiose, lactose, p-nitrofenil-ß-D-glucopiranosideo, p-nitrofenil-ß-D-fucopiranosídeo, p-nitrofenil-ß-D-xilanopiranosídeo, p-nitrofenil-ß-D-galactopiranosídeo, o-nitrofenil-ß-Dgalactopiranosídeo e salicina. Nenhuma das duas enzimas hidrolisou substratos poliméricos (CMC e Avicel), além de maltose, trealose e sacarose. Estudos cinéticos mostraram que a forma BGH I hidrolisou p-nitrofenil-ß-D-glucopiranosídeo e celobiose com a mesma velocidade máxima (25 U/mg). Porém, a afinidade aparente da enzima foi cerca de 7 vezes maior para o substrato sintético. Já os melhores substratos para BGH II foram p-nitrofenil-ß-D-fucopiranosídeo (VM/KM = 323,3 U/mg.mM) e celobiose (VM/KM = 168,0 U/mg.mM). De maneira muito interessante, a atividade de BGH II foi ativada por glicose ou xilose até concentrações de 400 mM, com efeito estimulatório máximo de cerca de 2 vezes próximo a 100 mM. Em contraste, a atividade de BGH I foi inibida em 95% por glicose 50 mM. Concluindo, a grande eficiência catalítica para substratos naturais, sua boa estabilidade térmica, forte estimulação por glicose e xilose, e tolerância a elevadas concentrações destes monossacarídeos no meio reacional, qualificam a enzima BGH II para aplicação na hidrólise de resíduos celulósicos.