Identificação e caracterização de substância amiloide em oócitos murinos e humanos e embriões de camundongos - Pimentel, Ricardo Novato (2019)
Introdução: Estudos prévios com leveduras evidenciaram um importante papel de substâncias amiloide (SA) na regulação da gametogênese, questionando seu potencial como marcador da qualidade gamética. Contudo, até o presente momento, nenhum estudo avaliou a presença de SA em óocitos e embriões de mamíferos. Objetivos: Descrever a presença, caracterizar o padrão de distribuição e comparar os níveis das SA em óocitos maduros e embriões pré-implantação, utilizando modelo murino. Identificar, caracterizar o padrão de distribuição e quantificar SA em oócitos humanos em diferentes estágios de desenvolvimento (VG- vesícula germinativa, MI- metáfase I e MII- metáfase II) e estabelecer a correlação entre os níveis de SA nos oócitos e as características clínicas de pacientes submetidas a estimulação ovariana controlada (EOC) para fertilização in vitro (FIV). Metodologia: Realizou-se um estudo piloto experimental, prospectivo, utilizando 20 oócitos maduros e 200 embriões pré-implantação de camundongos (1 célula, 2 células, 4 células, 8 células e blastocistos) e 46 oócitos humanos imaturos e in vitro maturados, doados por 11 pacientes submetidas à EOC para FIV. Oócitos em MII e embriões pré-implantação de camundongos congelados, imediatamente após o descongelamento, foram fixados para imunocoloração para visualização de SA por microscopia confocal e por microscopia imunoeletrônica de transmissão. Oócitos humanos imaturos (VG e MI) e maturados in vitro (VG Parado, MI, MI Parado e MII) também foram fixados e imunocorados para avaliação de SA, utilizando o mesmo anticorpo, por microscopia confocal. Para quantificar a imunocoloração de SA, nos oócitos e ao longo do desenvolvimento embrionário inicial, foi utilizado o programa ImageJ. Resultados: Em todas as amostras (camundongos e humanos), a imunocoloração para SA aparece por toda a zona pelúcida, bem como no citoplasma e no núcleo de oócitos, corpúsculos polares e embriões pré- implantação. Em camundongos, o estágio embrionário de 2 células apresentou níveis mais elevados de SA (69000187,4 DP 6733098,1 a.u.), quando comparado aos outros estágios de desenvolvimento (p <0,0001). A microscopia imunoeletrônica confirmou a presença de SA em oócitos e embriões pré- implantação. Em humanos, oócitos no estágio de VG, frescos, apresentaram níveis mais elevados de substância amiloide (4164.7 DP 1573.5 a.u.), quando comparados a oócitos em MI e MII (p = 0,008). Foi encontrada uma associação negativa entre níveis de SA e o índice de massa corporal (IMC) (-0,54; p = 0,0007), o número de dias de estimulação ovariana (-0,44; p = 0,002), a dose de hMG (-0,44; p = 0,002), o tempo entre a captação dos oócitos e a fixação das amostras (-0,33; p = 0,02) e o tempo decorrido após o trigger (-0,33; p = 0,02). Níveis elevados de SA foram encontrados em oócitos de pacientes que apresentaram valores de hormônio anti-mülleriano (AMH) entre 1 e 3 ng/ml, quando comparados a <1 ng/ml (4592,7 DP 2126,3 a.u vs. 737,3 DP 14,7 a.u.; p = 0,0002) e > 3 ng/ml (4592,7 DP 2126,2 a.u. vs. 3197,3 DP 895,0 a.u ; p = 0,006).16 Conclusões: Nós demonstramos pela primeira vez que as SA estão presentes no citoplasma e núcleo de oócitos murinos e humanos e embriões pré- implantação de camundongos. Também mostramos que as SA se distribuem de forma heterogênea ao longo do processo de maturação de oócitos humanos e do desenvolvimento pré-implantacional de embriões de camundongos. Embriões murinos no estágio de 2 células e oócitos humanos no estágio de VG apresentaram os maiores níveis de SA. Evidenciamos também uma correlação entre os níveis de SA nos oócitos humanos e características clínicas de bom prognóstico em pacientes submetidas a FIV, como por exemplo, baixo IMC e valores normais de AMH. Levando em conta que as SA estão envolvidas em mecanismos fundamentais relacionados a alterações celulares patológicas, bem como no processo de divisão celular, estudos futuros devem investigar o seu possível papel como biomarcador do envelhecimento e/ou da qualidade oocitária