Estudos bioquímicos e biofísicos das proteínas PA0575 e PA0285, componentes das vias de sinalização do c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa - Delphito, Leonardo (2020)
O segundo mensageiro c-di-GMP orienta importantes respostas fisiológicas em bactérias como progressão do ciclo celular, expressão de fatores de virulência, formação de biofilme, entre outros. A sinalização geral desse segundo mensageiro tem início dado estímulos externos e/ou internos e envolve proteínas que sintetizam o c-di-GMP (DGC, diguanilato ciclases, possuem o domínio GGDEF) e proteínas que o degradam (PDE, fosfodiesterases, possuem o domínio EAL). Por sua vez, o c-di-GMP atua sobre diversos alvos moleculares e resulta em respostas fenotípicas específicas. As vias de sinalização do c-di-GMP envolvem uma multiplicidade de DGCs, PDEs e efetores que são acionados especificamente e seletivamente para culminar em uma resposta fisiológica específica. Ainda está em estudo como essas vias não interferem entre si, entretanto, alguns mecanismos já foram propostos, como o confinamento do sinal perto do efetor, efetores com diferentes afinidades ao c-di-GMP, interação proteína-proteína, que pode envolver a formação de redes hierárquicas de proteínas. Em um estudo de interação proteína-proteína por duplo híbrido com todas as DGCs e PDEs de Pseudomonas aeruginosa, nosso grupo revelou um intrincado mapa de interação entre proteínas, incluindo o par PA0575-PA0285. Essas duas proteínas são transmembranares e possuem uma arquitetura na porção citoplasmática composta por PAS-GGDEF-EAL. Com o objetivo de confirmar a interação detectada in vivo entre PA0575 e PA0285 (realizada com construções citosólicas inteiras) e compreender melhor o funcionamento dessas proteínas, diversas construções de PA0575 e PA0285 foram expressas em E. coli, e purificadas por cromatografias de afinidade e de exclusão molecular. Em ensaios de crosslinking químico e termoforese em microescala foi possível confirmar e mapear a interação direta entre os domínios GGDEF de PA0575 e EAL de PA0285, cuja constante de dissociação (Kd) é aproximadamente 40 μM. Análises do estado de oligomerização por SEC-MALS com as construções de PA0575 e com o EAL de PA0285 mostraram que os domínios GGDEF e EAL isolados, e GGDEF-EAL de PA0575 são majoritariamente monoméricos em solução, o mesmo foi observado para o EAL de PA0285. Enquanto as construções PAS-GGDEF e PAS-GGDEF-EAL de PA0575 se apresentaram majoritariamente diméricas, de acordo com a necessidade de dimerização via N-terminal do GGDEF. Observado nos ensaios de crosslinking químico a construção inteira citosólica de PA0285 mostrou muito baixa formação de dímeros. Para verificar as atividades DGC e PDE de PA0575 e PA0285, foram realizados ensaios para detecção dos produtos reacionais por HPLC. Em concordância com os resultados de estado oligomérico, as construções diméricas PAS- GGDEF e PAS-GGDEF-EAL de PA0575 apresentaram atividade DGC, decorrente da necessidade de dimerização para atividade, e da dimerização dependente do N-terminal dos GGDEF. Todas as construções de PA0575 e PA0285 contendo o domínio EAL apresentaram atividade PDE, uma vez que o c-di-GMP pode induzir a dimerização do EAL, estado necessário para a atividade PDE. Os resultados de interação entre PA0575 e PA0285, a atividade DGC de PA0575 e a atividade PDE de PA0285 apresentados nesse trabalho são inéditos. O estudo aqui apresentado contribuí para um melhor entendimento das proteínas com GGDEF-EAL, integrantes das vias de sinalização do importante mensageiro intracelular bacteriano c-di-GMP.