Análise de genomas completos do HBV genótipos F e H encontrados no Brasil e no México através do método de sequenciamento de nova geração - Gionda, Patricia Oliveira (2021)
INTRODUÇÃO: A hepatite B é uma das principais patologias hepáticas e uma das doenças infecciosas mais desafiadoras à saúde pública mundial, com altos índices de morbidade e mortalidade relacionadas à evolução da infecção pelo vírus da hepatite B (HBV). Dez diferentes genótipos (A-J) do HBV já foram caracterizados até o presente momento, sendo os genótipos F e H os que apresentam maior divergência e estão associados com casos de hepatite B nas Américas. OBJETIVOS: O objetivo deste trabalho foi sequenciar genomas completos de amostras dos genótipos F e H do HBV provenientes do Brasil e do México utilizando a metodologia de sequenciamento de nova geração; e analisar características genéticas relevantes para a compreensão da história natural das infecções associadas com esses genótipos. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram incluídas 90 amostras de plasma com DNA do HBV detectável pertencentes aos genótipos F (n = 59) e H (n = 31), as quais foram submetidas à extração do DNA viral e posteriormente à amplificação do genoma completo do HBV. As amostras amplificadas foram submetidas à fragmentação do DNA, marcação e finalmente sequenciamento de última geração na plataforma MiSeq (Illumina). A análise dos dados foi desenvolvida por meio de ferramentas de bioinformática, nas quais foram avaliadas a qualidade das leituras obtidas e a cobertura de diferentes regiões do genoma. Os dados de sequenciamento foram analisados usando ferramentas de biotecnologia considerando qualidade e cobertura para alinhar os fragmentos e criar contigs mais longos. Sequências curadas e editadas foram então alinhadas com sequências de referência para determinar o subgenótipo viral e para detectar variantes de sequência em posições relevantes nos diferentes genes virais. Uma árvore filogenética foi construída usando métodos Bayesianos. Para a análise de variantes foi utilizada a ferramenta Freebayes. RESULTADOS: Foi possível amplificar o genoma completo do HBV de 31 amostras e dessas 18 foram sequenciadas com sucesso (HBV/F=16 e HBV/H=2).. A análise das sequências geradas mostrou que uma das amostras genótipo F apresentava co-infeccção com os subgenótipos F1b e F3, enquanto as demais amostras eram todas subgenótipo F2a. Não foram observados eventos de recombinação nos genomas de HBV/F e H sequenciados. As principais variantes observadas nesse estudo foram aquelas com alterações nos genes Pré-S e S que levam à interrupção prematura da síntese ou não produção das proteínas de superfície (7/18); e mutações no códon de iniciação do gene pré-core que resultam na falta de síntese da proteína HBeAg (11/18). Essas variantes foram observadas em alguns casos compondo a população viral majoritária e em outros a minoritária. CONCLUSÕES: Neste trabalho, desenvolvemos uma metodologia de NGS aplicada para os genótipos F e H, característicos da América Latina em amostras obtidas no México e no Brasil. Estas amostras tiveram seus genomas completos sequenciados e encontrou-se 15 amostras do subgenótipo F2a, uma amostra apresentando co-infecção com os subgenótipos F1b e F3 e 2 amostras do genótipo H