Clonagem, expressão e caracterização de fitase do fungo termofílico Myceliophthora thermophila - Ferreira, Gislene (2019)
Fitases são enzimas que hidrolisam o ácido fítico, substancias orgânicas complexas amplamente encontradas na natureza, principalmente em cereais e leguminosas. Nesses alimentos vegetais, o fitato e a principal fonte de fósforo, correspondendo entre cinquenta a oitenta por cento do conteúdo de fósforo orgânico. Entretanto, o fósforo do fitato e muito pouco utilizado por humanos e outros animais monogástricos, como suínos e aves, devido a ausência ou insuficiência das enzimas que o degradam. Assim, rações contém o fósforo orgânico do fitato e fósforo inorgânico adicionado, que é um mineral caro e não renovável. Em áreas de criação intensiva o excesso de fósforo e excretado no ambiente, causando problemas, tais como a eutrofização. Devido aos problemas ambientais e ao alto custo do fósforo inorgânico, a suplementação de enzimas, principalmente fitases, tem ganhado destaque, entre elas, as enzimas fúngicas, devido a sua estabilidade a diferentes temperaturas e pH. Além disso, técnicas de engenharia genética permitem a transferência de genes entre espécies, resultando em muitos benefícios, principalmente em relação ao aumento e melhoramento na produção de enzimas industriais. O objetivo deste trabalho foi realizar a clonagem, expressão heteróloga, purificação e caracterização bioquímica da enzima fitase (MtPhy) obtida a partir do fungo termofílico M. thermophila. O gene que codifica a enzima foi clonado no vetor pEXPYR e heterologamente expresso em A. nidulans. A proteína recombinante foi purificada e teve sua identidade confirmada por espectrometria de massas. Nas analises bioquímicas, apresentou pH ótimo de 5,0 e temperatura ótima de 60°C e manteve praticamente 100% de sua atividade a 50°C por 2 horas e pela análise de dicroísmo circular e ThermoFluor, apresentou desenovelamento de sua estrutura nas temperaturas de 63 e 67°C, respectivamente. Demonstrou atividade aumentada na presença de CaCl2 e MgCl2 e foi fortemente inibida por FeCl3, CuSO3 e SDS. Sua atividade especifica (954,8 U/mg) utilizando fitato de sódio foi bastante superior à de outras fitases descritas na literatura. Demonstrou-se efetiva na liberação do fósforo em rações e extremamente resistente as proteases, tripsina e pepsina, presentes no trato digestório de animais monogástricos, demonstrando dessa forma, seu elevado potencial para aplicação industrial.