Estudo das atividades antineoplásicas, citotóxicas e genotóxicas de toxinas isoladas do veneno de Rhinella schneideri - Baldo, Elisa Corrêa Fornari (2016)
Toxinas animais podem ser moléculas aplicáveis na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas para a pesquisa básica e aplicada. Recentemente, tem sido provado que medicamentos tradicionais chineses (TCM) compostos por substâncias extraídas de venenos de sapos são efetivos no tratamento de hepatocarcinoma e outros tipos de câncer. Desta forma, os objetivos deste estudo foram isolar toxinas do veneno do sapo Rhinella schneideri e avaliar suas ações antineoplásicas em diferentes linhagens celulares tumorais, além de avaliar a capacidade das toxinas em induzir instabilidade genômica (genotoxicidade e mutagenicidade). O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido à diálise resultando na fração de baixa massa molecular (VRs), a qual foi submetida a uma cromatografia de fase reversa em coluna C18 em um sistema FPLC. Avaliou-se a citotoxicidade do VRs em linhagens celulares HL-60, HepG2, PC-12, B16F10, MCF-7, SKBr-3, L292 e em hepatócitos primários isolados de ratos Wistar, através do ensaio do MTT. Analisou-se também a influência do VRs em diversos parâmetros mitocondriais, através de experimentos realizados com mitocôndrias isoladas de fígados de rato. Adicionalmente, foram isoladas três toxinas do VRs, denominadas Rs1, Rs2 e Rs3, com as quais foram realizados ensaios de citotoxicidade com células tumorais HepG2 e hepatócitos primários, análise da dissipação do potencial de membrana mitocondrial, avaliação de indução de fragmentação nuclear, análise da distribuição do ciclo celular, ensaios de avaliação de apoptose/necrose utilizando anexina V (AV) e iodeto de propídeo (PI) e ativação das caspases 3, 8 e 9 por western blot. O VRs (0,01 - 1000 ?g/mL) foi citotóxico para quatro das seis linhagens tumorais estudas (B16F10, HepG2, HL-60 e Skbr-3), demonstrou interferir pouco na viabilidade de células não tumorais L929, e citotóxico para hepatócitos. O VRs não induz efeitos significativos nos parâmetros bioenergéticos e oxidativos das mitocôndrias isoladas de fígado de ratos sadios, o que é um indicativo que o VRs não induz efeito citotóxico a estas células através da via mitocondrial. Além disto, o VRs diminuiu o acúmulo de espécies reativas de oxigênio. Através da cromatografia de fase reversa foram isoladas três toxinas do VRs, dentre as quais duas (Rs1 e Rs3 [1-1000 nM]) demonstraram ser mais citotóxicas às células tumorais HepG2. Estas toxinas pouco ou nada interferiram na viabilidade celular de hepatócitos primários, característica extremamente importante para uma possível aplicação como agente antitumoral. Nos experimentos de dissipação do potencial de membrana mitocondrial vi e de fragmentação nuclear (características de células em apoptose) em células HepG2 ambas as toxinas se mostraram capazes de induzir a dissipação do potencial de membrana (de maneira concentração-dependente) e também causaram a condensação da cromatina e fragmentação nuclear. A análise da distribuição do ciclo celular em células HepG2 após o tratamento com Rs1 e Rs3 demonstrou que as toxinas induziram aumento da fase G2/M em menores concentrações (10- 50 nM), seguido de uma diminuição de células nesta fase e aumento em fase G0/G1 em maiores concentrações (100 - 1000 nM). A quantidade de células apoptóticas foi maior em concentrações maiores, porém não estabeleceu relação concentração-resposta. Os ensaios realizados com anexina V e PI, demonstram que ambas as toxinas são capazes de induzir as células HepG2 à morte, principalmente pelo processo de apoptose. Os ensaios de caspases 3, 8 e 9 confirmaram a ativação da apoptose tanto pela via intrínseca quanto pela via extrínseca. Os ensaios de mutagenicidade e genotoxicidade revelaram que ambas as toxinas não causaram danos ao DNA das células HepG2. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo indicam a seletividade dos efeitos citotóxicos das toxinas Rs1 e Rs3 pelas células tumorais HepG2, induzindo estas células à morte principalmente por apoptose, justificando o potencial uso destas duas toxinas em terapias antitumorais.