Expressão Heteróloga de Inibidores Teciduais de Metaloproteinases (TIMP) com potencial terapêutico em Aspergillus nidulans - Cunha, Paula Macedo (2024)
Proteínas recombinantes, amplamente utilizadas nas indústrias de alimentos e biocombustíveis, estão ganhando cada vez mais importância no setor farmacêutico devido à sua versatilidade e especificidade no tratamento de diversas doenças. Vários tipos de células tem sido utilizadas para expressar e produzir proteínas recombinantes humanas, incluindo Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae e células de mamíferos. Este estudo teve como objetivo produzir proteínas da família Inibidores Teciduais de Metaloproteinases (TIMP) usando o fungo filamentoso Aspergillus nidulans. TIMPs são inibidores naturais de Metaloproteinases de Matriz (MMP), e o desequilíbrio dessas proteínas no corpo humano pode levar a vários processos patológicos envolvendo a degradação do tecido conectivo. Primeiramente foram feitas análises de bioinformática das características estruturais das TIMPs e suas interações com MMP2 e MMP9, essa análise utilizou a combinação de ferramentas incluindo o AlphaFold2, HDOCK e PyMOL. Posteriormente, os genes sintéticos e otimizados das TIMPs foram amplificados por PCR e fusionados aos genes das enzimas da família Glicosil hidrolases (GH7.1) ligados usando um sítio de TEV protease, essa construção foi inserida no vetor pEXPYR por Gibson Assembly e clonadas em E. coli para posterior transformação mediada por PEG em A. nidulans. A atividade das proteínas foi confirmada por meio de ensaio de zimograma reverso e FRET contra MMP. Para otimizar a expressão de proteínas, os transformantes foram cultivados em meio mínimo suplementado com diferentes concentrações do indutor (maltose 2%, 3% e 5%) e em diferentes parâmetros. Como resultados foram obtidos três transformantes positivos fGH7.1T1, GH7.1T1 e fGH7.1T3, os quais apresentaram atividade tanto em MMP2 quanto em MMP9, sendo a T1 e T3 capazes de inibir 40% e 50%, respectivamente, da atividade de MMP2. Quando produzido, o transformante fGH7-T1 apresentou melhor rendimento de produção quando em condições sem agitação com 5% de maltose por 2 dias, produzindo 127 μg/ml da proteína de interesse. Já os transformantes fGH7T1 e fGH7T3 tiveram melhores rendimentos quando em condições agitadas com 3% de maltose por 6 dias, produzindo respectivamente 195 μg/ml e 229 μg/ml de proteína de interesse. Ao serem produzidas em biorreator o rendimento máximo da fGH7T1 e fGH7T3 foi de 82 μg/ml em 54h e 124 μg/ml em 78h respectivamente, esse rendimento pode ter sido menor do que em outras condições pela quantidade de protease produzida que aumentou em 6 vezes. Esse trabalho demonstra a viabilidade de produção de proteínas humanas em A. nidulans, e destaca como as condições de produção de proteínas recombinantes influencia significativamente o rendimento. Além disso, esse trabalho mostra a possibilidade de usar a GH7.1 como proteína carreadora, introduzindo um novo método de expressão heteróloga de proteínas humanas.