Efeito da MAPK8 sobre o estresse oxidativo e a esteroidogênese em células adrenocorticais com atividade reduzida de NNT - Gebenlian, Juliana Lourenço (2023)
Introdução: Novos estudos sobre a fisiopatologia adrenal revelaram que a proteína nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (NNT) é essencial para os mecanismos de defesa antioxidante do córtex adrenal. Mutações deletérias no gene NNT têm sido associadas à deficiência familiar de glicocorticoides (DFG), uma forma hereditária de insuficiência adrenal primária. Modificações no estado redox celular, como observado na deficiência de NNT, levam ao aumento da proteína quinase 8 ativada por mitógeno (MAPK8). Objetivo: Analisar os efeitos do crosstalk entre NNT e MAPK8 na linhagem celular de carcinoma adrenocortical H295R (H295R). Verificar se o aumento da MAPK8 compensa o aumento da formação das espécies reativas de oxigênio (EROs) e a redução da produção de cortisol resultantes da deficiência de NNT nas células H295R. Métodos: O gene NNT nas células H295R foi silecido por meio de siRNA. O efeito da deficiência de NNT na expressão da MAPK8 nessas células foi avaliado por meio de qPCR), Western blot (WB) e imunofluorescência. Em situação basal e após estímulo com 10uM de forskolina (FSK), a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) pelas células NNT nontarget (NT) ou deficientes em NNT (siNNT) foi mensurada utilizando o marcador mitocondrial DCFDA/H2DCDFDA. A viabilidade celular foi avaliada utilizando citometria de fluxo (BD-FACS). A esteroidogêneses adrenal foi avaliada pela dosagem de cortisol do meio celular por radioimunoensaio (RIE). Resultados: O silenciamento do gene NNT reduziu seus níveis de RNAm e proteína em 78% (p<0,0001) e 50% (p=0,001), respectivamente, sem comprometer a viabilidade das células H295R. Após o silenciamento de NNT houve aumento significativo da expressão gênica (p=0,01) e proteica da MAPK8 assim como diminuição da secreção de cortisol (p=0,004). Não ocorreram alterações na produção de EROs intracelular dessas células. Quando estas células deficientes de NNT foram submetidas ao estímulo pela FSK, observouse o aumento significativo na expressão gênica (p=0,03) e proteica da MAPK8 porém houve diminuição da secreção de cortisol (p=0,01). Novamente não houve alteração na produção de EROs intracelular. Conclusão: As células H295R deficientes em NNT são capazes de manter a homeostase mitocondrial mas apresentam prejuízo na secreção de cortisol em situação basal. A ativação da via da MAPK8 parece ser um potencial mecanismo de compensação nesse processo. Em situação de estresse, as células H295R deficientes para NNT parecem preservar o equilíbrio redox em detrimento da esteroidogênese.