Bioprospecção de cianobactérias brasileiras dirigida à obtenção de cianopeptídeos inibidores de proteases - Paiva, Fernanda Cristina Rodrigues de (2015)
Algumas espécies de cianobactérias podem produzir diferentes tipos de peptídeos bioativos (cianopeptídeos), como aeruginosinas, cianopeptolinas, microgininas, microviridinas, anabaenopeptinas e microcistinas. As microcistinas, que compõem a classe mais conhecida na literatura científica, são hepatotoxinas e inibem fosfatases do tipo 1 e 2A. Já as microgininas, moléculas inibidoras da enzima conversora de angiotensina (ECA) e de outras proteases, são importantes candidatas ao desenvolvimento de fármacos anti-hipertensivos. No entanto, as funções fisiológicas desses compostos ainda não foram completamente elucidadas. O objetivo desse estudo é identificar e isolar cianopeptídeos, especialmente da classe das microgininas, produzidos por cepas de cianobactérias brasileiras. O fracionamento dos extratos das cianobactérias foi biomonitorado por meio de ensaios de inibição da ECA. Para tanto, foram produzidos extratos de culturas de 59 cepas de cianobactérias mantidas em laboratório e, quando pertinente, seguiu-se o pré-fracionamento por extração em fase sólida em coluna de fase reversa. As frações obtidas foram testadas para a inibição da ECA e analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). Nos casos em que houve inibição, o fracionamento foi continuado por cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa para o isolamento dos cianopeptídeos. As espécies analisadas pertencem aos gêneros: Microcystis, Oscillatoria, Radiocystis, Sphaerocavum, Sphaerospermopsis, Cylindrospermopsis, Leptolyngbya, Pleurocapsa, Chrooccocidiopsis, Nostoc, Brasilonema, Desmonostoc, Oculatella e Limnothrix. Além de outras espécies das famílias Pseudanabaenaceae, Nostocaceae e Michochaetaceae que não tiveram suas identificações concluídas. Nas análises por HPLC-DAD não foram encontrados picos com espectros de UV característicos de microgininas nas 59 cepas avaliadas. Esses resultados foram corroborados por análises por LC-MS, nas quais também não foi possível a detecção desses compostos. Como método de triagem, as análises por LC-MS triplo quadrupolo foram conduzidas via precursor ion scan para o monitoramento das perdas m/z 128 e 142, que são fragmentos oriundos do aminoáciodo Ahda, exclusivamente presente em microgininas. Algumas linhagens se revelaram produtoras de variantes do cianopeptídeo microcistina, possuindo absorção UV máxima em 238 nm. Amostras de Israel, doadas pelo Prof. Shmuel Carmeli, da Universidade de Tel Aviv, também foram analisadas por espectrometria de massas no modo precursor ion para a investigação da produção de microgininas. Foram encontrados íons de m/z 128 e 142 em uma das amostras de Israel. Ensaios enzimáticos iniciais da ECA foram realizados com frações das cepas controle LTPNA 08 e 09, sabidamente produtoras de microgininas. Realizou-se a otimização do método inicial de detecção dos cianopeptídeos para que fosse procedido o isolamento dos compostos de interesse da cultura LTPNA 08. As frações obtidas foram analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) e isoladas por um coletor de frações. 4,8 mg de microgininas foram obtidos com o isolamento das moléculas a partir de 3 g de biomassa seca da linhagem. Ensaios enzimáticos de inibição da ECA com as frações isoladas de microgininas e microcistina-LR comercial também foram realiazados. Os resultados mostram que tanto as microgininas quanto a microcistina-LR comercial apresentam potencial de inibição da enzima ECA. As microgininas e a microcistina-LR podem ser consideradas como novas moléculas a serem estudadas para o desenvolvimento de fármacos inibidores da ECA. Continuar a investigação da produção desses compostos é relevante tanto por seu potencial ecotoxicológico quanto por seu potencial farmacológico.