Clonagem e expressão heteróloga de enzimas do sistema celulolítico visando a degradação de biomassa lignocelulósica - Almeida, Paula Zaghetto de (2019)
O Brasil possui um grande potencial para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa lignocelulósica. Neste contexto para o desenvolvimento de um bioprocesso limpo e sustentável faz-se necessária a utilização de grandes quantidades de enzimas, sobretudo as celulases. As celulases são responsáveis pela quebra da cadeia de celulose em unidades de glucose. Para baratear e ampliar a produção destas enzimas uma das estratégias que podem ser adotadas é a expressão heteróloga. Neste trabalho foram expressas em Escherichia coli uma endoglucanase de Trichoderma reesei (TR), uma endoglucanase de Eubacterium cellulosolvens com a estrutura completa (MI+MII) e parcial (MII) e uma ?-glucosidase de Anoxybacillus thermarum (BG). A enzima TR, que foi expressa com a cepa de E. coli Origami2, destacou-se por ter pH ótimo baixo, de 3,5 e temperatura ótima de 65°C, ter uma excelente estabilidade entre os pH 2,5 e 7, e ser ativada em 88% por Mn2+. As endoglucanases MI+MII e MII se destacaram pela produção fácil e rápida, gerando grande quantidade de enzimas com baixo custo, possuem pH ótimo de 4,5 e temperatura de 45°C para MI+MII e 50°C para MII. Ambas em extrato bruto são estáveis nos pH de 4 a 7 e temperaturas de 40°C e 50°C por até 24 horas. A BG destacouse, além da produção rápida e pouco dispendiosa, pela excelente tolerância ao produto, sendo a mesma ativada em concentrações de até 0,4 M de glucose. Seu pH ótimo foi de 7 e a temperatura de 65°C, o km de 0,35 mM de ?NPG e Vmáx cerca de 7000 U/mg, variando pouco conforme as diferentes metodologias aplicadas. A BG foi estável entre os pH 5,5 a 8 e na temperatura de 50°C por até 48 horas. As enzimas TR e BG foram aplicadas na degradação de bagaço-de-cana e capim-elefante, in natura ou tratados por autohidrólise, juntamente com um extrato bruto de enzimas provenientes do cultivo de Aspergillus brasiliensis. Os melhores rendimentos foram obtidos na hidrólise com o capim-elefante in natura, resultando na produção até 30 µmol/mL de açúcares redutores.