Hemocidina sintética Hb40-61a: estudo das propriedades, mecanismo de ação e interação com nanopartículas poliméricas - Carvalho, Larissa Anastácio da Costa (2012)
O aumento na incidência de infecções fúngicas e a alta toxicidade ou elevado índice de resistência associado aos antimicóticos comerciais, criou um mercado carente de novas drogas. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) surgem como uma alternativa promissora ou fonte de conhecimento por desempenhar ação inibidora de crescimento e/ ou letal contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, parasitas e/ ou vírus, além de atividade antitumoral e efeito imunomodulador. Como os mecanismos pelos quais eles o fazem são diferentes daqueles das drogas não peptídicas, os AMPs estão pouco associados ao desenvolvimento de resistência microbiana. A hemoglobina (Hb) é uma fonte de peptídeos com funções biológicas diversas. O fragmento 33-61 (Hb33-61) da cadeia α da Hb bovina foi o primeiro AMP descrito a ser gerado in vivo no trato gastrointestinal do carrapato Boophilus microplus. Nossos estudos posteriores usando CD e H1-RMN revelaram que a amidação C-terminal deste fragmento o tornava ainda mais ativo que o primeiro e que em presença de micelas de SDS o Hb33-61a apresenta uma dobra β na porção N-terminal (Lys40-Phe43) e outra (Ser49- Ser52) seguida de α-hélice no C-terminal (Ala53-Ala60), bem como um segmento Pro44-Leu48 capaz de mover-se independentemente e agir como uma dobradiça. Nossas investigações usando análogos sintéticos truncados do Hb33-61a mostraram que o Hb40-61a poderia ser sua porção mínima ativa por apresentar comportamento conformacional idêntico. Nossos estudos subsequentes enfocando as suas propriedades evidenciaram a sua capacidade de causar morte rápida de cepas de Candida, incluindo C. albicans resistentes ao fluconazol e extravasamento de conteúdo e formação de poros em LUVs, revelando sua ação permeabilizante de membrana. Em continuidade ao estudo do Hb40-61a, investigamos no presente trabalho as suas propriedades e o seu mecanismo de ação contra C. albicans. Para isso, sintetizamos, purificamos e caracterizamos esta hemocidina, o seu análogo inteiro composto por D aminoácidos (ent-Hb40-61a) e o seu análogo marcado com 5 (6) carboxifluoresceína (FAM-Hb40-61a). Ensaios com eritrócitos humanos confirmaram a baixa atividade hemolítica desses AMPs em meio de alta e baixa força iônica. O análogo ent-Hb40-61a apresentou a mesma atividade antifúngica que o análogo L, evidenciando um mecanismo de ação não-estereoespecífico. Análises de células de Candida tratadas com FAM-Hb40-61a por microscopia confocal mostraram que em ½ MIC e MIC o peptídeo deposita-se na membrana plasmática e é internalizado, respectivamente. Citometria de fluxo demonstrou que na MIC cerca de 97% das células encontram-se marcadas pelo peptídeo, confirmou a influência negativa da alta força iônica em sua atividade, mostrou que a internalização celular na MIC é independente da temperatura e que a alteração no metabolismo energético da célula afeta de maneira negativa a internalização do peptídeo. Ensaios de permeabilidade celular com Syto 09 e iodeto de propídeo confirmaram danos progressivos à membrana plasmática de C. albicans com o aumento da concentração do Hb40-61a. Experimentos usando DiBAC4(5) e de DPH revelaram que o Hb40-61a altera o potencial de membrana e afeta sua fluidez, respectivamente. Imagens preliminares das células tratadas e não tratadas com Hb40-61a por microscopia de força atômica (AFM) sugeriram alterações nas células de C. albicans após tratamento com a hemocidina. Medidas preliminares do diâmetro médio das células de C. albicans revelaram que elas diminuem após o tratamento com o peptídeo, o que pode ser mais um indício de dano à membrana plasmática por formação de poros e extravasamento de conteúdo intracelular. Assim, obtivemos fortes indícios de que o alvo do Hb40-61a é, de fato, a membrana plasmática das células de Candida, de que ele apresenta potencial de uso tópico para tratamento de candidíase e pode servir como modelo para o desenho de novas drogas antimicrobianas, peptídicas ou não, com propriedades ainda mais valiosas e índices terapêuticos mais elevados. Testes preliminares mostraram que é possível a adsorção do Hb40-58a à nanopartículas de PSS e que, em relação ao peptídeo livre, este arranjo mantém a atividade antifúngica com MIC superior e apresenta menor atividade hemolítica.