Produção, caracterização e aplicação de diferentes classes de enzimas com potenciais biotecnológicos e biomédicos - Cortez, Anelyse Abreu (2022)
Biofilmes dentais caracterizam um problema de saúde oral pois podem culminar no desenvolvimento de cáries e outras doenças bucais bastante onerosas. Seus principais constituintes são os polissacarídeos extracelulares insolúveis. Tais componentes estão diretamente relacionados com a cariogenicidade das comunidades bacterianas e são formados por ligações glicosídicas (1 → 3)- α e (1 → 6)- α.Considerando a estrutura química dessas moléculas e sua importância para o biofilme dental, o emprego de enzimas exógenas capazes de clivar essas ligações glicosídicas, denominadas glucanases, se mostra uma estratégia promissora para o controle desses biofilmes. No presente trabalho, uma (1 → 3)- α (PmGH87) e uma (1 → 6)-α (CoGH66) glucanase de Prevotella melaninogenica e Capnocytophaga ochraceae, respectivamente, foram clonadas e expressas heterologamente. Após sua purificação, as condições ótimas de pH e temperatura para a atividade catalítica de cada enzima foram determinadas, bem como sua termo estabilidade estrutural em diferentes tampões e pHs. Através de modelagem preditiva, as estruturas tridimensionais de ambas as enzimas foi avaliada. Por fim, a atividade dessas glucanases na inibição da formação e degradação de biofilmes pré-formados de Streptococcus mutans crescidos em meio de cultura contendo 0,1 ou 1% de sacarose foi avaliada em termos de quantificação de biomassa total, polissacarídeos insolúveis, microscopia confocal e produto de hidrólise. Os resultados sugerem que tanto a PmGH87 quanto a CoGH66 são capazes de inibir a formação dos biofilmes crescidos em condição limitada ou abundante de sacarose. Entretanto, a combinação de ambas não resulta em efeito sinérgico. Os dados de degradação de biofilmes pré-formados apontam um efeito tempo-dependente para o tratamento com cada enzima sozinha. Além disso, observou-se um efeito sinérgico e dose-dependente proveniente do tratamento enzimático combinado das glucanases, onde a maior degradação observada foi de 95,5% em 30 minutos de tratamento para o biofilme crescido em baixa concentração de sacarose, e 93,8% após 2 horas de tratamento para o biofilme crescido em condição abundante do açúcar, cujos graus de sinergismo calculados foram de 5,54 e 3,18, respectivamente. Em conclusão, ambas as glucanases estudadas neste trabalho são efetivas na inibição da formação e na degradação de biofilmes previamente formados de S. mutans. Esses resultados são essenciais para o desenvolvimento de aplicações biotecnológicas e biomédicas que visam o controle de biofilmes bacterianos.