Estudos das características cinéticas da fosfatase alcalina reconstituída em sistemas vesiculares - Simão, Ana Maria Sper (2008)
A fosfatase alcalina é uma fosfomonohidrolase inespecífica, capaz de hidrolisar monoésteres de fosfato, pirofosfato, diésteres de fosfato, bem como catalisar reações de transfosforilação, e é denominada \"alcalina\" por sua habilidade de efetuar estas reações mais eficientemente em pH acima do neutro (pH 8-11). O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia para a obtenção de uma fração de membrana rica em fosfatase alcalina a partir de culturas de células osteoblásticas, provenientes de medula óssea de rato, sem a utilização de solventes orgânicos, colagenase ou outras proteases. O procedimento padronizado é simples e reprodutível, com a vantagem da considerável redução do tempo necessário para se obter esta fração de membrana, o que contribui para um menor efeito desnaturante sobre a enzima. A fosfatase alcalina é inserida à membrana plasmática por uma âncora GPI e foi solubilizada tanto com polidocanol (1%, p/v) quanto com PIPLC (0,2 U/mL), hidrolisando diversos substratos (PNFF, ATP, PPi, ADP, ?-glicerofosfato, glicose-1-fosfato, glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato) e sendo inibida por inibidores clássicos deste grupo de enzimas (levanisol, teofilina, ZnCl2, vanadato, fosfato e arsenato). Os efeitos de lipossomos constituídos por DPPC, DPPC:DPPS (9:1 e 8:2, razão molar) e DPPC:DODAB (9:1 e 8:2, razão molar) na habilidade tanto de inserção da enzima nos sistemas vesiculares, bem como de modulação da atividade da enzima reconstituída, também foram avaliados. A reconstituição da fosfatase alcalina nos lipossomos mistos constituídos de DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) e DPPC:DODAB (8:2) proporcionou máxima incorporação da atividade PNFFase da enzima (cerca de 90%, 75% e 90%, respectivamente) após 4 horas, 5 horas e 40 minutos, respectivamente, de incubação dos diversos lipossomos com a proteína. No entanto, utilizando lipossomos de DPPC:DODAB (9:1), apenas cerca de 50% da atividade PNFFase da enzima foi incorporada aos sistemas mesmo após 5 horas de incubação. Para os lipossomos com carga positiva, uma maior proporção de DODAB nos sistemas de DPPC favoreceu a inserção da fosfatase alcalina aos sistemas após um curto período de incubação. Para os lipossomos com carga negativa, as diferentes proporções de DPPS utilizadas não exerceram grande influência tanto na velocidade de incorporação quanto na quantidade de enzima incorporada aos sistemas. Para todos os sistemas utilizados, o processo de incorporação é tempo dependente. A eletroforese dos proteolipossomos de DPPC revelou a presença de uma única banda protéica bem intensa, com massa molecular ao redor de 60 kDa (quando desnaturada), que apresentou atividade de fosfomonohidrolase em condição não-desnaturante, com massa molecular de 120 kDa. Assim, com esta estratégia, foi possível obter proteolipossomos ricos em fosfatase alcalina devido à inserção preferencial da âncora de GPI às bicamadas lipídicas, em detrimento das outras proteínas que não interagem favoravelmente com os sistemas vesiculares, comprovando que a metodologia de reconstituição padronizada pode ser usada eficientemente na obtenção de sistemas de proteolipossomos sem a necessidade de uma etapa de purificação prévia da enzima solubilizada, de modo a se obter um máximo de incorporação da enzima às vesículas com mínima perda em atividade. A reconstituição da enzima empregando-se células ghost resseladas foi obtida incubando-se volumes iguais de enzima (23 ?g/mL) e células ghost (0,22 mg/mL), por 2 horas, a 25ºC, com cerca de 40% da atividade PNFFase da fosfatase alcalina incorporada às vesículas. Para verificar o efeito do microambiente da membrana sobre a atividade da enzima reconstituída, foram determinados os parâmetros cinéticos de hidrólise para diferentes substratos (ATP, PPi e PNFF). Para todos os substratos, uma única classe de sítios de hidrólise foi observada, com valores de K0,5 que variaram de 0,14 a 2,7 mM. Excesso de PPi e ATP no meio reacional inibiu as atividades PPase e ATPase da enzima reconstituída, respectivamente, em todos os sistemas estudados. A hidrólise de PPi apresentou efeitos cooperativos positivos para todos os sistemas, enquanto que para a hidrólise de ATP, uma pequena cooperatividade positiva foi observada apenas para os sistemas constituídos de DPPC e contendo DPPS em sua composição. Assim, a enzima não perdeu a habilidade de hidrolisar nenhum dos substratos quando reconstituída nos diferentes sistemas vesiculares, e todos os dados obtidos reforçam a hipótese de que a composição lipídica do microambiente onde a fosfatase alcalina se encontra exerce grande influência na modulação tanto da atividade da enzima quanto da interação da mesma com os sistemas vesiculares. Assim, os resultados obtidos fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão dos mecanismos de interação da fosfatase alcalina com a membrana, quanto para estudos da função da enzima durante o processo de biomineralização.