Estudos de reconhecimento biomolecular por eletroforese capilar - Hillebrand, Sandro (2005)
Esta tese trata do desenvolvimento de métodos bioanalíticos, baseados na técnica de eletroforese capilar, para duas aplicações distintas: a análise de complexos formados pela ligação entre proteínas e DNA e detecção e monitoramento de hidrólise de GTP catalisada por enzimas. No primeiro capítulo descreve-se uma investigação sobre a viabilidade de ensaios tipo EMSA (?electrophoretic mobility shift assay?) em chips com microcanais para eletroforese. Os fatores de transcrição purificados c-Jun(AP1) e p-50(NFkB) foram usados nos estudos de ligação a sondas de DNA fita dupla contendo as seqüências consenso de ligação dos fatores AP1, NFkB e AP2. As sondas de DNA sintéticas continham como modificação a marcação com o corante fluorescente Cy5 ligado à extremidade 5?, sendo que as mesmas seqüências não marcadas foram usadas para experimentos de competição. Ensaios tipo EMSA em chip puderam ser realizados em cerca de 2 h com baixo consumo de amostra e sem a necessidade de usar marcação com material radioativo. A sondas de DNA e os complexos formados nas reações de ligação foram analisados no Bioanalyzer usando tanto o procedimento padrão para a análise de DNA quanto um protocolo modificado. Nesta modificação não foi usado corante de intercalação mas 4,9 nM de Cy5-dCTP que foi adicionado ao gel, permitindo apenas a detecção de DNA previamente marcado. Apesar da necessidade de ajustes no método para cada proteína testada, foi mostrado o potencial de se substituir o método de EMSA em gel por métodos baseados em eletroforese em chip. Um experimento de competição foi realizado com sucesso mostrando a ligação do fator de transcrição p-50 à sonda contendo a seqüência consenso NFkB. Este experimento foi considerado como prova de princípio para a hipótese estudada. No segundo capítulo relata-se o desenvolvimento de um método para a detecção e monitoramento in vitro de atividade nucleotídeo-trifosfatase. O método que se mostrou robusto e reprodutível foi aplicado para investigar a atividade GTPase de uma proteína recombinante contendo o domínio catalítico de uma septina humana SEPT4 / Bradeiona (GST-rDGTPase). O exemplo de aplicação demonstra que a técnica de eletroforese capilar pode substituir o método tradicionalmente usado com marcação radioativa para detecção de atividade GTPase inclusive em estudos de cinética enzimática. Os parâmetros cinéticos determinados para a GST-rDGTPase foram: vmax = 1.7 μ M min-1 ± 0.1 and Km = 1.0 mM ± 0.3; kcat = 9 x 10-3 SM-1. O efeito de co-fatores como Mg2+ and Mn2+ também foi estudado. O método analítico descrito também se mostrou útil para a análise de di- e trifosfatos de outros nucleotídeos.