Avaliação do dano no DNA em células infectadas pelo Trypanosoma cruzi - Gonzáles Córdova, Raul Alexander (2020)
A Doença de Chagas, conhecida também como Tripanossomíase Americana, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi afeta aproximadamente 7 milhões de pessoas globalmente. Segundo dados atuais da Organização Mundial da Saúde, na américa Latina, 21 países são considerados regiões endêmicas além de que cerca de 70 milhões de pessoas estão em risco de infecção ao redor do mundo. Só no Brasil mais de q milhão de pessoas vivem com a infecção. Durante o processo de infecção, o T. cruzi pode infectar diferentes tipos celulares e tecidos. Uma vez dentro da célula hospedeira, o parasito tem a capacidade subverter respostas celulares da célula hospedeira incluindo a evasão do sistema imune e supressão da atividade oxidativa para, no final, manter a infecção e sua sobrevivência. No entanto, pouco se sabe sobre o dano no DNA da célula hospedeira durante o processo de infecção. Nesta dissertação de mestrado demonstramos pela primeira vez a existência de dano no DNA em células não fagocíticas LLC-MK2 infectadas pelo T. cruzi. A resposta ao dano no DNA foi observada através do uso de anticorpos específicos contra as proteínas envolvidas nas vias de resposta ao dano no DNA empregando técnicas de western blotting, imunofluorescência e o ensaio cometa. Nossos dados mostraram que, no início do processo de infecção, a célula hospedeira foi capaz de detectar o dano acometido no seu DNA mediante a ativação da proteína γH2AX, que é a molécula marcadora de dano inicial. O dano induzido no DNA das células hospedeiras infectadas pelo T. cruzi ativou a proteína γ53BP1, que apresentou picos máximos em 6 e 12 horas de infecção sugerindo, em conjunto, que o acometimento do dano no DNA foi na fita dupla do DNA. Além disso, mostramos através de microscopia Confocal a co-localização entre as proteínas γH2AX e γ53BP1 confirmando a ativação da cascata de sinalizações e recrutamento da via de resposta ao dano no DNA das células infectadas. Sugerimos, também, que a via de reparo ativada foi a junção de extremidades não homologas (NHEJ) nas células infectadas pelo T. cruzi mediante análise da proteína γDNA-PK formando focos de reparo nos núcleos das células hospedeiras com picos máximos em 12 horas. Para confirmar estes achados sobre os danos causados pelo T. cruzi durante a infecção na célula hospedeira, realizamos o ensaio cometa, que é um ensaio físico capaz de visualizar os fragmentos de DNA mediante aplicação de corrente elétrica e formação da cauda do cometa. Observamos o pico máximo de quebras do DNA após 12 horas de infecção. Quando analisamos a dinâmica de ativação de pares de proteínas marcadoras e mediadoras (γH2AX e γ53BP1), mediadoras e de reparo (γ53BP1 e γDNA-PK) e marcadoras e de reparo (γH2AX e γDNA-PK) observamos um comportamento diretamente proporcional entre γH2AX e γ53BP1 a partir de 6 horas de infecção e, também, entre γ53BP1 e γDNA-PK ao longo de todo o processo de infecção estudado. A sua vez, observamos uma relação inversamente proporcional em 12 horas entre H2AX e DNA-PK. Em conjunto, nossos dados inovadores, auxiliam na compreensão da Doença de Chagas, especificamente na resposta ao dano acometido no DNA da célula hospedeira durante o processo de infecção pelo T. cruzi.